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2010年版药典三部附录Ⅳ

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅳ

中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录Ⅳ 电泳法

电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场作用下,带电粒子按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外,各电泳法照下述方法操作。

2 附录Ⅳ A 醋酸纤维素薄膜电泳法

2.1 试剂

(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)  称取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g,加水溶解使成1000ml。

(2)氨基黑染色液  称取氨基黑10B 0.5g,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(3)漂洗液  量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。

(4)透明液  量取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml,混匀。

2.2 测定法

取醋酸纤维素薄膜,裁成2cm×8cm膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置含巴比妥缓冲液(pH8.6)的电泳槽架上,通过滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白质含量约5%的供试品溶液2~3μl,在0.4~0.6mA/cm[总电流量=电流量(mA/cm)×每条膜的宽度(cm)×膜条数]电流条件下电泳;同时取新鲜人血清作对照,电泳时间以白蛋白丙种球蛋白之阿的电泳展开距离约2cm为宜。电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑或丽春红染色液中,2~3分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中,待全部浸透后,取出平铺于洁净的玻板上,干燥后即成透明薄膜,可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白质组分曲线图,以人血清作对照,按峰面积计算各蛋白质组分的含量(%)。

2.3 【附注】

采用全自动电泳仪操作时,参考仪器使用说明书进行。

3 附录Ⅳ B 琼脂糖凝胶电泳法

3.1 试剂

(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)  称取巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g,加水适量,加热使之溶解,放冷至室温,再加叠氮钠0.15g,溶解后,加水稀释至1500ml。

(2)1.5%琼脂糖溶液  称取琼脂糖1.5g,加水50ml

和巴比妥缓冲液(pH8.6) 50ml,加热使完全溶胀。

(3)0.5%氨基黑溶液  称取氨基黑10B 0.5g,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(4)脱色液  量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。

(5)溴酚蓝指示液  称取溴酚蓝50mg,加水使之溶解,并稀释至100ml。

3.2 对照品

正常人血清或其他适宜的对照品。

3.3 供试品溶液的制备

生理氯化钠溶液将供试品稀释成蛋白质浓度为1%~2%的溶液。

3.4 测定法

趁热将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上,其厚度约3mm,静置,待凝胶凝固成无气

泡的均匀薄层后,于琼脂糖凝胶板负极端的1/3处打孔,孔径2~3mm。置含有巴比妥缓冲液(pH8.6)的电泳槽架上,测定孔加适量供试品溶液和1滴溴酚蓝指示液,对照孔加适量对照品及1滴溴酚蓝指示液。用3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8.6)接触,100V恒压条件下电泳2小时(指示剂迁移到前沿)。电泳结束后,用0.5%氨基黑溶液染色,再用脱色液脱色至背景无色。

4 附录Ⅳ C SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷,消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质按分子大小分离。

4.1 仪器

恒压或恒流电源,垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。

4.2 试剂

(1)水(电阻率不低于18.2MΩ·cm)。

(2)A液  1.5molL三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷18.15g,加适量水溶解,用盐酸调pH值至8.8.加水稀释至100ml。

(3)B液  30%蔼烯酰胺-0.8% N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶液(避光保存)。

(4)C液  1%十二烷基硫酸钠溶液。

(5)D液  10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺溶液。(6)E液  10%过硫酸铵溶液,临用前配制。

(7)F液  0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6.05g加适量水溶解,用盐酸调pH值至6.8,加水稀释至100ml。

(8)电极缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠1g,加适量水溶解,用盐酸调pH值至8.3,加水稀释至1000ml。

(9)供试品缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷0.303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠0.8g,量取盐酸0.189ml、甘油4ml,加水溶解并稀释至10ml,此溶液用于非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,如用于还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,则再加β-巯基乙醇2ml。

(10)分子量标准  供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。

(11)固定液  量取甲醇250ml、冰醋酸60ml,加水稀释至500ml。

(12)漂洗液  量取乙醇100ml、冰醋酸50ml,加水稀释至1000ml。

(13)辅染液  称取重铬酸钾10g,量取硝酸2ml加适量水溶解并稀释至200ml。用前40倍稀释。

(14)银染液  称取硝酸银2.04g.加水溶解并稀释至1000ml。

(15)显色液  称取碳酸钠30g,加适量水溶解,加甲醛0.5ml并稀释至1000ml。

(16)终止液  量取冰醋酸10ml,加水稀释至1000ml。(17)考马斯亮蓝染色液  称取考马斯亮蓝R250 1g,加入甲醇200ml、冰醋酸50ml、水250ml,混匀。

(18)考马斯亮蓝脱色液  量取甲醇400ml、冰醋酸100ml与水500ml,混匀。

4.3 供试品溶液的制备

将供试品与供试品缓冲液按3:1的比例混匀,100℃水浴加热3~5分钟。

4.4 测定法

(1)制备分离胶溶液  按下表制成分离胶溶液,灌入模具内至一定高度,加水封顶,室温下聚合(室温不同,聚合时间不同)。

凝胶种类

分离胶溶液

浓缩胶

溶液

凝胶浓度

5%

7. 5%

10%

12.5%

15%

17.5%

4.5%

A液

4

4

4

4

4

4

B液

2.7

4

5.4

6.7

8

9.4

1.35

C液

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

0.9

试液/ml

D液

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.07

E液

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.07

F液

2.25

H2O

7.3

6

4.88

3.3

2.28

0.88

4.33

(2)制各浓缩胶溶液  待分离胶溶液聚合后,用滤纸吸去上面的水层,再灌入浓缩胶溶液(配方见上表),插入样品梳,注意避免气泡出现。

(3)加样  待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳,将电极缓冲液注满电泳槽前后槽,在供试品孔中加入供试品溶液5μg(银染法)或10μg以上(考马斯亮蓝染色法)。

(4)电泳  接通电源、冷凝水,以恒流10mA条件下开始电泳,至供试品溶液进入分离胶后将电流调至20mA,直至电泳结束。

(5)固定与染色

①银染法  除另有规定外,银染法一般不用于定量试验;做定性试验时,上样量可以适当增加。将电泳后的凝胶浸入固定液中过夜,取出,用漂洗液漂洗3次(温度应不低于25℃),每次10分钟;漂洗后的凝胶浸于辅染液中7~10分钟后取出,用水浸洗3次,每次2分钟;将浸洗后的凝胶浸于银染液中,置较强日光或类似光源下照射30分钟,再于室内光线下放置20分钟;将凝胶自银染液中取出,用水浸洗2次,每次1分钟;然后将凝胶浸于显色液中,每隔2分钟换液1次,直至蛋白质条带显色完全;将凝胶浸于终止液中10分钟后,取出凝胶保存于水中。

②考马斯亮蓝法  将电泳后的凝胶浸入染色液中过夜取出,浸入脱色液中,直至凝胶底色几乎无色,取出凝胶保存在水中。

4.5 结果计算

非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶经扫描进行纯度分析;还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶中分子量标准,经扫描获得分子量标准曲线,计算供试品的分子量。

5 附录Ⅳ D 等电聚焦电泳法

两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度,由于蛋白质为两性化合物,其所带的电荷与介质的pH值有关,带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移,当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电)时,电流达到最小,不再移动。本法用于检测蛋白质类供试品的等电点。

5.1 第一法 等电聚焦垂直板电泳

5.1.1 试剂

(1)水(电阻率不低于18.2MΩ·cm)。

(2)A液  称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g,加适量水溶解,并稀释至100ml,双层滤纸滤过,避光保存。

(3)B液  10%过硫酸铵溶液,临用前配制。

(4)供试品缓冲液(4倍浓度)  量取甘油8ml、40%两性电解质(pH3~10)溶液4ml,加水至20ml。加0.1%甲基红溶液20μl。

(5)固定液  称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g,加水溶解并稀释至300ml。

(6)脱色液(平衡液)  量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml,加水稀释至2000ml。

(7)染色液  称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g,加脱色液300ml,在60~70℃水浴中加热,使溶解。

(8)保存液  量取甘油30ml,加脱色液300ml,混匀。

(9)正极液(0.01mol/L磷酸溶液)  量取磷酸1ml,加水至1800ml。

(10)负极液(0.01mol/L氢氧化钠溶液)  称取氢氧化钠0.4g,加水溶解并稀释至1000ml。

5.1.2 供试品溶液的制备

供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后,与供试品缓冲液按3:1(体积比)混匀(供试品溶液最终浓度应在每1ml含0.5mg以上,如供试品浓度太低,则需要采用适当方法浓缩)。

5.1.3 测定法

装好垂直平板电泳槽,压水,于玻璃板和玻璃纸之间加入60%甘油1ml。取水12ml、甘油2ml、A液4.0ml、两性电解质(pH3~10)溶液(或其他两性电解质)1.0ml,混匀,脱气,再加B液72μl,N,N,N',N'-四甲基乙二胺3μl,混匀后注入槽内聚合1小时。每孔加供试品缓冲液20μl,接通冷却循环水,于10℃、250V(约10mA)条件下电泳30分钟。每孔加样20μl,于10℃、500v(约10mA),上限电压2000V条件下,电泳约3.5小时,同时做等电点标准。电泳结束后,即将凝胶放入固定液中固定20分钟以上;取出,放入平衡液中20~30分钟;再放入染色液中40~60分钟,然后用脱色液浸洗至背景无色,取出放入保存液中30分钟;亦可做成干胶保存。以标准品的等电点(pI)对其相应的迁移距离作直线回归,将供试品的迁移距离代入直线回归方程,求出供试品的等电点。

5.2 第二法 等电聚焦水平板电泳

5.2.1 试剂

(1)水(电阻率应不低于18MΩ·cm)。

(2)A液  称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g,加适量水溶解,并稀释至100ml,双层滤纸滤过,避光保存。

(3)B液  10%过硫酸铵溶液,临用前配制。

(4)固定液  称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g,加水溶解并稀释至300ml。

(5)脱色液(平衡液)  量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml.加水稀释至2000ml。

(6)染色液  称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g,加脱色液300ml,在60~70℃水浴中加热,使溶解。

(7)保存液  量取甘油30ml,加脱色液300ml,混匀。

(8)正极液(0.5mol/L磷酸溶液)  量取磷酸50ml.加水至1800ml。

(9)负极液(0.2mol/L氢氧化钠溶液)  称取氢氧化钠8g,加水溶解并稀释至1000ml。

5.2.2 供试品溶液的制备

将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐,并使蛋白质含量调节至每1ml含0.5mg以上(如供试品蛋白质浓度太低,则需采用适当方法浓缩)。

5.2.3 测定法

量取A液6.25ml、pH 3~10两性电解质(或其他两性电解质)1.5ml、水17.1ml,抽气5~10分钟,加B液175μl、N,N,N',N'-四甲基乙二胺20μl,混匀后缓慢地注入水平模具内,室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上,其间涂以液体石蜡煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条,然后分别放于阳极与阴极上,将加样滤纸放在凝胶上。加供试品溶液5~30μl。将电极对准电极条的中心,加盖,在上限电压2000V、上限电流50mA、功率为每1cm胶1W、温度4℃的电泳条件下,开始电泳,电泳2.5小时;同时做等电点标准。电泳30分钟后去掉加样滤纸,电泳结束后,即将凝胶放入固定液中固定20分钟以上;取出放入平衡液20~30分钟,再放入染色液40~60分钟,然后用脱色液浸洗至背景无色,取出放入保存液中30分钟,晾干;亦可做成干胶永久保存。以标准品的等电点(pI)对其相应的迁移距离作直线回归,将供试品的迁移距离代入直线回归方程,求出供试品的等电点。

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