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2010年版药典三部附录Ⅹ

目录

1 拼音

2010nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅹ

中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录Ⅹ

2 附录Ⅹ A 重组乙型肝炎疫苗酵母)体外相对效力检查

本法系以酶联免疫法测定供试品中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg)含量,并以参考品为标准,采用双平行线分析法计算供试品的相对效力。

2.1 试剂

(1) PBS (pH7.2)  称取氯化钠8.850g、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 0.226g和磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O)1.698g,加适量水溶解,调pH值至7.2,加水稀释至1000ml。

(2)供试品处理液  量取20%二乙醇胺1.25ml和10% Triton X-100 0.20ml,加PBS 8.55ml,混匀备用。

(3)供试品稀释液  称取牛血白蛋白10.0g,加PBS溶解并稀释至1000ml,备用。

2.2 参考品溶液及供试品溶液的制备

精密量取参考品及供试品各0.1ml,分别加入0.1ml供试品处理液,加盏混匀,在20~28℃静置30~35分钟。将处理后的参考品和供试品分别以供试品稀释液进行适当稀释,稀释后取1: 2000、1: 4000、1: 8000、1: 16000、1:32000及其他适宜稀释度进行测定,每个稀释度做双份测定。阴性对照为供试品稀释液(双份),阴性对照和阳性对照均不需稀释。

2.3 测定法

按试剂盒使用说明书进行。试剂盒阴性和阳性对照的吸光度均值应在试剂盒要求范围内,试验有效。3次测定的数据均用量反应平行线测定法(2010年版药典二部附录XIV)计算相对效力。以3次相对效力的几何均值为其体外相对效力。以参考品为标准,供试品相对效力应不小于0.5,判为合格。

3 附录Ⅹ B 重组人促红素体内生物学活性测定法(网织红细胞法)

本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红细胞生成的作用,给小鼠皮下注射EPO后,其网织红细胞数量随EPO注射剂量的增加而升高。利用网织红细胞数对红细胞数的比值变化,通过剂量反应平行线法检测EPO体内生物学活性。

3.1 试剂

(1)乙二胺四乙酸二钾抗凝剂  称取乙二胺四乙酸二钾100mg,加生理氯化钠溶液10ml溶解,混匀,使用时新鲜配制。

(2)稀释液  称取0.1g牛血清白蛋白,加生理氯化钠溶液溶解并稀释至100ml,即得。

3.2 标准品溶液的制备

按标准品说明书,将EPO标准品复溶,用稀释液将EPO标准品稀释成高、中、低3个剂量EPO标准品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

用稀释液将供试品稀释成高、中、低3个剂量与EPO标准品溶液单位相近的供试品溶液。

3.4 测定法

按低、中、高(如10IU/鼠、20IU/鼠、40IU/鼠)3个剂量组,分别给近交系6~8周龄小鼠(雌性BALB/C小鼠)或B6D2F1小鼠皮下注射EPO标准品及供试品溶液,每组至少4只,每鼠注射量为不大于0.5ml。在注射后的第4天从小鼠眼眶采血3~4滴,置于预先加入200μl EDTA-K2抗凝剂的采血管中。取抗凝血,用全自动网织红细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret%)。按注射剂量(IU)对Ret%的量反应平行线测定法(2010年版药典二部附录XIV)计算供试品体内生物学活性。

4 附录Ⅹ C 干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑制法)

本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用,用结晶紫对存活的WISH细胞染色,在波长570nm处测定其吸光度,可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线,以此测定干扰素生物学活性。

4.1 试剂

(1) MEM或RPMI 1640培养液  取MEM或RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存

(2)完全培养液  量取新生牛血清10ml,加MEM或RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。

(3)测定培养液  量取新生牛血清7ml,加MEM或RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。

(4)攻毒培养液  量取新生牛血清3ml,加MEM或RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。

(5)消化液  称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌

(6)染色液  称取结晶紫50mg,加无水乙醇20ml溶解后,加水稀释至100ml,即得。

(7)脱色液  量取无水乙醇50ml、醋酸0.1ml,加水稀释至100ml。

(8) PBS  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。

4.2 标准品溶液的制备

取人干扰素生物学活性测定的国家标准品,按说明书复溶后,用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。供试品溶液的制备  将供试品按标示量溶解后,用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。

4.3 测定法

使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按(1:2)~(1:4)传代,每周2~3次,于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液,用PBS洗2次后消化和收集细胞,用完全培养液配制成每1ml含2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时;将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加入100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时;弃去细胞培养板中的上清液,将保存的水泡性口炎病毒(VSV,-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100CCID50,每孔100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时(镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/ml);然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔加入染色液50μl,室温放置30分钟后,用流水小心冲去染色液,并吸干残留水分,每孔加入脱色液100μl,室温放置3~5分钟。混匀后,用酶标仪以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果:

式中  Pr为标准品生物学活性,IU/ml;

DS为供试品预稀释倍数;

Dr为标准品预稀释倍数;

ES为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;

Er为标准品半效量的稀释倍数。

5 附录Ⅹ D 重组人白介素-2生物学活性测定法(CTLL-2细胞/MTT比色法

本法系依据在不同白介素-2 (IL-2)的浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同,以此检测IL-2的生物学活性。

5.1 试剂

(1)  RPMI 1640培养液  取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解弗稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。

(2)基础培养液  量取新生牛血清(FBS) 10ml,加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。

(3)完全培养液  量取基础培养液100ml,加重组人白介素-2至终浓度为每1ml含400~800IU。4℃保存。

(4) PBS  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。

(5)噻唑蓝(MTT)溶液  称取MTT 0.1g,加PBS溶解并稀释至20ml,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

(6)裂解液  15%十二烷基硫酸钠溶液,使用期限不得超过12个月。

5.2 CTLL-2细胞

应为偏酸性、略微浑浊液体,传代后48~60小时用于重组人白介素-2生物学活性测定。

5.3 标准品溶液的制备

取重组人白介素-2生物学活性测定的国家标准品,按使用说明书复溶后,用基础培养液稀释至每1ml含200IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

5.4 供试品溶液的制备

将供试品按标示量复溶后,用基础培养液稀释成每1ml约含200IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

5.5 测定法

CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养至足够量,离心收集CTLL-2细胞,用RPMI 1640培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液中配制戚每1ml含6.0×105个细胞的细胞悬液,于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试晶溶液的96孔细胞培养板中,每孔加入细胞悬液50μl.于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时;然后每孔加入MTT溶液20μl.于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时后,每孔加入裂解液150μl,于37℃、5%二氧化碳条件下保温18~24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体,放入酶标仪,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果:

式中  Pr为标准品生物学活性,IU/ml;

DS为供试品预稀释倍数;

Dr为标准品预稀释倍数;

ES为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;

Er为标准品半效量的稀释倍数。

6 附录Ⅹ E 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法(NFS-60细胞/MTT比色法)

本法系依据小鼠骨髓白血病细胞(NFS-60细胞)的生长状况因重组人粒细胞刺激因子(G-CSF)生物学活性的不同而不同,以此检测G-CSF的生物学活性。

6.1 试剂

(1) RPM1 1640培养液  取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加膏霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。

(2)基础培养液  量取新生牛血清100ml,加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。

(3)完全培养液  基础培养液中加入重组人粒细胞刺激因子至最终浓度为每1ml含10~20ng。

(4) PBS  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。

(5)噻唑蓝(MTT)溶液  称取MTT粉末0.10g.溶于PBS 20ml中,配制成每1ml含5.0mg的溶液,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

(6)裂解液  量取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml,加异丙醇,配制成500ml的溶液。室温避光保存。标准晶溶液的制备  取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品,按说明书复溶后,用基础培养液稀释至每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔,每孔分别留50μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

6.2 供试品溶液的制备

将供试品按标示量复溶后,用基础培养液稀释成约每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔,每孔分别留50μl供试品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

6.3 测定法

NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~4.0×105个细胞,传代后24~36小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物,离心收集NFS-60细胞,用RPMI 1640培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液配成每1ml含2.0×105个细胞的细胞悬液,置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养40~48小时。每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl,混匀后,放入酶标仪,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果:

式中  Pr为标准品生物学活性,IU/ml;

DS为供试品预稀释倍数;

Dr为标准品预稀释倍数;

ES为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;

Er为标准品半效量的稀释倍数。

7 附录Ⅹ F 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法(TF-1细胞/MTT比色法)

本法系依据人红细胞白血病细胞(简称TF-1细胞)的生长状况因重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)生物学活性的不同而不同.以此检测GM-CSF的生物学活性。

7.1 试剂

(1)RPMI 1640培养液  取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU.再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。

(2)基础培养液  量取新生牛血清100ml,加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。

(3)完全培养液  基础培养液加重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每1ml含5.0ng或每1ml含80IU。

(4) PBS  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g,磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g.加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。

(5)噻唑蓝(MTT)溶液  称取MTT粉末0.10g,溶于PBS 20ml中,配制成每1ml含5mg的溶液,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

(6)裂解液  量取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml,加异丙醇配制成500ml的溶液。

7.2 标准品溶液的制备

取重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子标准品,按说明书复溶后,用基础培养液稀释至每1ml含10~20IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

7.3 供试品溶液的制备

将供试品按标示量复溶后,用基础培养液稀释成约每1ml含10~20IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

7.4 测定法

TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,控制细胞浓度为每Iml含2.0×105~7.0×105个细胞,传代后24~36小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物,离心并收集TF-1细胞,用基础培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液中,配成每1ml含4.0×105个细胞的细胞悬液,置37℃备用。向加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中加入细胞悬液,每孔50μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养48~52小时后,每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时,以上操作在无菌条件下进行。再向上述各孔加裂解液100μl,混匀后,放入酶标仪,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果:

式中  Pr为标准品生物学活性,IU/ml;

DS为供试品预稀释倍数;

Dr为标准品预稀释倍数;

ES为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;

Er为标准品半效量的稀释倍数。

8 附录Ⅹ G 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法(细胞增殖法/MTT比色法)

本法系依据重组牛碱性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3细胞)的生长具有刺激作用,Balb/c 3T3细胞的生长状况因重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性的不同而不同,以此检测重组牛碱性成纤维细胞生长因子的生物学活性。

8.1 试剂

(1) RPM11640培养液  取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L).加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。

(2)维持培养液  量取新生牛血清4ml,加RPMI1640培养液至1000ml。

(3)完全培养液  量取新生牛血清100ml,加RPMI1640培养液至1000ml。

(4) PBS  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。

(5)噻唑蓝(MTT)溶液  称取MTT粉末0.10g,加PBS 20ml使溶解,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

8.2 标准品溶液的制备

取重组牛碱性成纤维细胞生长因子标准品,按说明书复溶后,用维持培养液稀释至每1ml含40IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

8.3 供试品溶液的制备

将供试品按标示量复溶后,用维持培养液稀释成每1ml约含40IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

8.4 测定法

Balb/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞,传代后24~36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液,消化并收集细胞,用完全培养液配成每1ml含5.0×104~1.0×105个细胞的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液,于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液,加入标准品溶液和供试品溶液,每孔100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养64~72小时。每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上步骤在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后,向每孔中加入二甲基亚砜100μl,混匀后,放入酶标仪,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果:

式中  Pr为标准品生物学活性,IU/ml;

DS为供试品预稀释倍数;

Dr为标准品预稀释倍数;

ES为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;

Er为标准品半效量的稀释倍数。

9 附录Ⅹ H 重组人表皮生长因子生物学活性测定法(细胞增殖法/MTT比色法)

本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3细胞)的生长具有刺激作用,Balb/c3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学活性的不同而异,以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。

9.1 试剂

(1)  RPMI 1640培养液  取RPM11640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。

(2)维持培养液  量取新生牛血清4ml,加RPMI1640培养液至1000ml。

(3)完全培养液  量取新生牛血清100ml,加RPMI1640培养液至1000ml。

(4) PBS  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。

(5)噻唑蓝(MTT)溶液  称取MTT粉末0.10g,加PBS 20ml使溶解,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

9.2 标准品溶液的制备

取重组人表皮生长因子标准品,按说明书复溶后,用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

9.3 供试品溶液的制备

将供试品按标示量复溶后,用维持培养液稀释成每1ml约含50IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

9.4 测定法

Balb/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞,传代后24~36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液,消化和收集细胞,用完全培养液配成每1ml含5.0×104~8.0×104个细胞的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液,于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液,加入标准品溶液和供试品溶液,每孔100μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养64~72小时。每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后,向每孔中加入二甲基亚砜100μl,混匀后在酶标仪上,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果:

式中  Pr为标准品生物学活性,IU/ml;

DS为供试品预稀释倍数;

D=为标准品预稀释倍数;

ES为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;

Er为标准品半效量的稀释倍数。

10 附录Ⅹ I 重组链激酶生物学活性测定法

本法系依据链激酶纤溶酶原形成的复合物能激活游离的纤溶酶原为有生物学活性的纤溶酶,纤溶酶能降解人纤维蛋白为可溶性的纤维蛋白片段,在纤维蛋白平板上出现透明的溶解圈,以此定量测定重组链激酶的生物学活性。

10.1 试剂

(1)人凝血酶溶液  用生理氯化钠溶液配制成每1ml含100IU,于-20℃保存。

(2)人纤溶酶原溶液  用生理氯化钠溶液配成每1ml含0.5mg,于-20℃保存。

(3)人纤维蛋白原溶液  试验前配制,配制前将人纤维蛋白原和备用的生理氯化钠溶液均置37℃水浴预热15分钟,然后用适量生理氯化钠溶液溶解,置37℃水浴静置保温30分钟,使其完全溶解,配制成每1ml含6mg溶液待用。

10.2 标准品溶液的制备

按使用说明书,将重组链激酶生物学活性测定国家标准品复溶后,用生理氯化钠溶液稀释成每1ml含1000IU、250IU、62.5IU、15.6IU、3.9IU5个稀释度,待用。

10.3 供试品溶液的制备

供试品按标示量加生理氯化钠溶液复溶后,用生理氯化钠溶液稀释至约每1ml含100IU或1μg。

10.4 测定法

称取琼脂糖125mg,加生理氯化钠溶液23ml,煮沸使之溶胀,置55~60℃水浴中平衡,加每1ml含100IU人凝血酶溶液14μl,人纤溶酶原溶液(每1ml含0.5mg) 280μl,边加边摇匀,加每1ml含6mg人纤维蛋白原溶液2.2ml,不停地摇匀,浑浊后立即倒入直径8cm的平皿中,水平放置充分凝固后,4℃放置至少30分钟待用(应在2天之内使用)。在含纤维蛋向平皿内打孔,孔径为2mm,在孔内分别加入供试品溶液和标准品溶液,每孔10μl,每个稀释度做2孔,37℃湿盒水平放置24小时。纵向和横向量取溶圈直径,各2次,取平均值。以标准品溶液各个稀释度的生物学活性的对数对其相应的溶圈直径的对数作直线回归,求得直线回归方程,根据供试品的溶圈直径的对数求得供试品的生物学活性。

11 附录Ⅹ J 人凝血因子效价测定法(一期法)

本法系用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅱ效价。

11.1 试剂

(1)稀释液  称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g,溶于适量水中,用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3,再加水稀释至2000ml。临用前,加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%。

(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)。

(3)人凝血因子Ⅱ缺乏血浆  人凝血因子Ⅱ含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。

11.2 人凝血因子Ⅱ标准品溶液的制备

用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅱ,再用稀释液分别做10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴备用。

11.3 供试品溶液的制备

用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml约含1IU凝血因子Ⅱ,再用稀释液做10倍、20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

11.4 测定法

量取供试品溶液0.1ml,加入凝血因子Ⅱ缺乏血浆0.1ml,混匀,置37℃水浴中保温一定时间(一般3分钟),然后加入已预热至37℃的含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml,记录凝固时间。

用不同稀释度的人凝血因子Ⅱ标准品溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

以人凝血因子Ⅱ标准品溶液效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数作直线回归,求得直线回归方程,计算供试品溶液人凝血因子Ⅱ效价,再乘以稀释倍数,即为供试品人凝血因子Ⅱ效价(IU/ml)。

11.5 【附注】

(1)直线回归相关系数应不低于0.98。

(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,2管之差不得超过均值10%,否则重测。

(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。

(4)采用全自动凝血仪操作,按仪器使用说明书进行。

12 附录Ⅹ K 人凝血因子Ⅶ效价测定法(一期法)

本法系用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅶ效价。

12.1 试剂

(1)稀释液  称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g,溶于适量水中.用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3,再加水至2000ml。临用前加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%。

(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)。

(3)人凝血因子Ⅶ缺乏血浆  人凝血因子Ⅶ含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。

12.2 人凝血因子Ⅶ标准品溶液的制备

用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ,再用稀释液分别做10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴备用。

12.3 供试品溶液的制备

用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml约含1IU凝血因子Ⅶ,再用稀释液做10倍、20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

12.4 测定法

量取供试品溶液0.1ml,加入凝血因子Ⅶ缺乏血浆0.1ml,混匀,置37℃水浴保温一定时间(一般3分钟),然后加人已预热至37℃的含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml,记录凝固时间。

用不同稀释度的人凝血因子Ⅶ标准品溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

以人凝血因子Ⅶ标准品溶液效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数作直线回归,求得直线回归方程,计算供试品溶液人凝血因子Ⅶ效价,再乘以稀释倍数,即为供试品人凝血因子Ⅶ效价(IU/ml)。

12.5 【附注】

(1)直线回归相关系数应不低于0.98。

(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,2管之差不得超过均值10%.否则重测。

(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。

(4)采用全自动凝血仪操作,按仪器使用说明书进行。

13 附录Ⅹ L 人凝血因子Ⅸ效价测定法(一期法)

本法系用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅸ效价。

13.1 试剂

(1)3.8%枸橼酸钠溶液  称取无水枸橼酸钠9.5g,加水溶解并稀释至250ml。

(2)咪唑缓冲液(pH 7.3)  称取咪唑0.68g、氯化钠1.17g,溶于100ml水中,加入0.1mol/L盐酸溶液42.2ml,再加水稀释至200ml,即得。

(3)稀释液  取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液,混合,加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%。

(4)激活的部分凝血活酶APTT)试剂。

(5)人凝血因子Ⅸ缺乏血浆  为人凝血因子Ⅸ含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。

(6)生理氯化钠溶液。

(7)0.05mol/L氯化钙溶液  称取氯化钙(CaCl2·2H2O) 147g,加水溶解并稀释至1000ml,配制成1mol/L氯化钙贮存液。临用前,用水稀释20倍,配制成0.05mol/L氯化钙溶液。

13.2 人凝血因子Ⅸ标准品溶液的制备

用生理氯化钠溶液将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅸ,再用稀释液分别做10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴待用。

13.3 供试品溶液的制备

若供试品中含有肝素,先用硫酸鱼精蛋白中和供试品中的肝素。测定时先用生理氯化钠溶液稀释成每1ml约含1IU凝血因子Ⅸ,再用稀释液做10倍、20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

13.4 测定法

取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml,置37℃水浴中保温一定时间(一般4分钟),加入凝血因子Ⅸ缺乏血浆0.1ml、供试品溶液0.1ml,混匀,置37℃水浴中保温一定时间(一般5分钟),加入已预热至37℃的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。

用不同稀释度的人凝血因子Ⅸ标准品溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

以人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数作直线回归,求得直线回归方程,计算供试品溶液人凝血因子Ⅸ效价,再乘以稀释倍数,即为供试品人凝血因子Ⅸ效价(IU/ml)。

13.5 【附注】

(1)直线回归相关系数应不低于0.98。

(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,2管之差不得超过均值10%,否则重测。

(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。

(4)采用全自动凝血仪操作,按仪器使用说明书进行。

14 附录Ⅹ M 人凝血因子Ⅹ效价测定法(一期法)

本法系用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅹ效价。

14.1 试剂

(1)稀释液  称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g,溶于适量水中,用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3,再加水稀释至2000ml。临用前加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%。

(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)。

(3)人凝血因子Ⅹ缺乏血浆  人凝血因子Ⅹ含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。

14.2 人凝血因子Ⅹ标准品溶液的制备

用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子X,再用稀释液分别做10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴备用。

14.3 供试品溶液的制备

用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml约含1IU凝血因子Ⅹ,再用稀释液做10倍和20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

14.4 测定法

取供试品溶液0.1ml,加入凝血因子Ⅹ缺乏血浆0.1ml,混匀,置37℃水浴中保温一定时间(一般3分钟),然后加入已预热至37℃的含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml,记录凝固时间。

用不同稀释度的人凝血因子Ⅹ标准品溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

以人凝血因子Ⅹ标准品溶液效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数作直线回归,求得直线回归方程,计算供试品溶液人凝血因子Ⅹ效价,再乘以稀释倍数,即为供试品人凝血因子Ⅹ效价(IU/ml)。

14.5 【附注】

(1)直线回归相关系数应不低于0.98。

(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,2管之差不得超过均值10%,否则重测。

(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。

(4)采用全自动凝血仪操作,按仪器使用说明书进行。

15 附录Ⅹ N 人凝血因子Ⅷ效价测定法(一期法)

本法系用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅷ效价。

15.1 试剂

(1)3.8%枸橼酸钠溶液  称取无水枸橼酸钠9.5g,加水溶解并稀释至250ml。

(2)咪唑缓冲液(pH 7.3)  称取咪唑0.68g和氯化钠1.17g,加水使溶解成100ml,加入0.1mol/L盐酸溶液42.2ml.再加水稀释至200ml,即得。

(3)稀释液  取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合,加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%。

(4)激活的部分凝血活酶(APTT)试剂。

(5)人凝血因子Ⅷ缺乏血浆  为人凝血因子Ⅷ含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。

(6)0.05mol/L氯化钙溶液  称取氯化钙(CaCl2·2H2O) 147g,加水溶解并稀释至1000ml,配制成1mol/L氯化钙贮存液。用前用水稀释20倍,配制成0.05mol/L氯化钙溶液。

15.2 人凝血因子Ⅷ标准品溶液的制备

用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ,再用稀释液分别做10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴待用。

15.3 供试品溶液的制备

用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml约含1IU凝血因子Ⅷ,再用稀释液做10倍和20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

15.4 测定法

取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml,置37℃水浴保温一定时间(一般4分钟),加人凝血因子Ⅷ缺乏血浆0.1ml、供试品溶液0.1ml,混匀,置37℃水浴中保温一定时间(一般5分钟),加入已预热至37℃的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。

用不同稀释度的人凝血因子Ⅷ标准品溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作.

以人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数作直线回归,求得直线回归方程。计算供试品溶液人凝血因子Ⅷ效价,再乘以稀释倍数,即为供试品人凝血因子Ⅷ效价(IU/ml)。

15.5 【附注】

(1)直线回归相关系数应不低于0.98。

(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,2管之差不得超过均值10%,否则重测。

(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。

(4)采用全自动凝血仪操作,按仪器使用说明书进行。

16 附录Ⅹ O 人免疫球蛋白白喉抗体效价测定

本法系依据绵羊红细胞经醛化和鞣酸化处理后,具有较强的吸附蛋白质能力,能将白喉类毒素吸附于红细胞表面上,若遇到供试品中相应抗体,会发生抗原抗体结合,产生特异性凝集,通过比较凝集反应终点测定供试品中白喉抗体效价。

16.1 试剂

(1)1%兔血清生理氯化钠溶液  无菌采集兔全血分离血清.置56℃,30分钟灭能。取0.5ml兔血清加49.5ml生理氯化钠溶液,混匀。

(2)白喉抗体诊断红细胞悬液  用1%兔血清生理氯化钠溶液复溶冻干白喉抗体诊断红细胞至5%悬液。

16.2 白喉抗体标准品溶液的制备

用1%兔血清生理氯化钠溶液将白喉抗体标准品稀释至每1ml含0.2HAU。

16.3 供试品溶液的制备

用1%兔血清生理氯化钠溶液将供试品稀释4倍。

16.4 测定法

在UV型斑凝板上,用1%兔血清生理氯化钠溶液将供试品溶液做2倍系列稀释,每孔留25μl,再向每孔加25μl白喉抗体诊断红细胞悬液,置振荡器混匀30~60秒,放湿盒内37℃结合1小时。

在UV型衄凝板上,用1%兔血清生理氯化钠溶液将白喉抗体标准品溶液做2倍系列稀释,每孔,留25μl,自“再向每孔加25μl白喉抗体诊断红细胞悬液”起,同法操作。在UV型血凝板上,加1%兔血清生理氯化钠溶液25μl,自“再向每孔加25μl白喉抗体诊断红细胞悬液”起,同法操作,为阴性对照。

阴性对照孔呈典塑的“-”,否则试验不成立,应重试。以出现“++”为判定终点,按下式计算供试品白喉抗体效价:

式中E为出现“++”的最高稀释倍数的标准品的白喉抗体效价,HAU/ml;

n为出现“++”的供试品的最高稀释倍数;

F为静注人免疫球蛋白供试品蛋白质含量,g/ml;

或人免疫球蛋白供试品蛋白质含量,g/ml。

16.5 【附注】

(1)判定标准

“-”红细胞集中在孔底中央,呈一边缘光滑致密的小红点;

“+”大部分红细胞沉于孔底中央,周围有少量的红细胞;

“++”红细胞部分凝集,孔底中央有一疏松的小红圈;

“+++”大部分红细胞凝集呈均匀分布,孔底中央有很弱的小红圈;

“++++”红细胞凝集呈均匀分布。

(2)血凝板孔要保持清洁干净,避免表面磨损,否则红细胞不易下沉,易出现假阳性

17 附录Ⅹ P 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法

本法系依据特异性抗体(免疫球蛋白)Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结合,抗体暴露出Fc段补体C1q的结合位点,从而激活后续的补体各成分,最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂,释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲线,计算人免疫球蛋白激活补体活性的功能指数(IFc),以此测定供试品Fc段生物学活性。

17.1 试剂

(1)PBS(pH7.2)  称取无水磷酸氢二钠1.02g、无水磷酸二氢钠0.34g、氯化钠8.77g,加适量水溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH值至7.2,再加水稀释至1000ml。

(2)钙-镁贮备液  称取氯化钙1.10g、氯化镁5.08g,加水25ml使溶解。

(3)巴比妥-钙镁贮备液  称取氧化钠51.85g、巴比妥钠6.37g,加水1000ml使溶解,加入钙-镁贮备液3.125ml,用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3,再加水稀释至1250ml。除菌过滤后4℃保存备用。

(4)牛白蛋白-巴比妥缓冲液  称取牛血清白蛋白0.15g于巴比妥贮备液20ml中,加水溶解并稀释至100ml。临用前配制。

(5)1.3mg/L鞣酸PBS(pH7.2)溶液

A液  称取鞣酸1mg,加PBS (pH7.2) 10ml,使溶解;

B液  量取A、液0.1ml,加PBS (pH7.2) 7.5ml,混匀,即得,临用前配制。

(6)10%氯化铬溶液  称取氯化铬5g,加生理氯化钠溶液50ml使溶解。4℃保存(可保存半年)。

(7) 1%氯化铬溶液  取10%氯化铬溶液0.1ml,加生理氯化钠溶液0.9ml,混匀。临用前配制。

17.2 敏化红细胞的制备

A液  取健康人抗凝的O型血3人份以上混合,用PBS洗涤3次,最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量压积红细胞悬浮于1.3mg/L鞣酸PBS(1:40),置37℃水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次,最后用PBS制备成2.5%红细胞悬浮液。

B液  用PBS适当稀释的白喉类毒素或腮腺炎病毒与1%氯化铬溶液0.25ml混合(10:1)后,置37℃水浴中轻摇15分钟。

将A液、B液按1:4混合,置37℃水浴中轻摇30分钟。离心,去上清液,用PBS将沉淀(敏化红细胞)洗涤3次,用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞,调节至适宜浓度,使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0.1。参考品溶液的制备  用1mol/L氢氧化钠溶液将参考品pH值调节至6.8~7.0,再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至每1ml含40mg。

17.3 供试品溶液的制备

用1mol/L氢氧化钠溶液将供试品pH值调至6.8~7.0,再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每1ml含40mg。

17.4 测定法

取供试品溶液0.9ml,加敏化红细胞悬液0.1ml,混匀,置37℃水浴中轻摇30分钟。离心,去上清液,用牛白蛋白-巴比妥缓冲液1ml洗涤红细胞,共洗3次。末次离心后弃上清液800μl,向沉淀中加入600μl预热到37℃的牛白蛋白-巴比妥缓冲液,充分混匀,2分钟后再加入已稀释至每1ml含150 CH50的补体200μl,混匀后立即照紫外-可见分光光度法2010年版药典三部附录Ⅱ A)在波长541nm处测定起始吸光度(AS),之后,每隔1分钟测定1次,即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量。分别取参考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)0.9ml,自“加敏化红细胞悬液0.1ml”起,同法操作。按公式(1)分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IFc):

式中  S'为用AS修正Sexp得到的曲线斜率;

AS分别为供试品、参考品、阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度;

Sexp分别为根据供试品、参考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出的相邻3点间的曲线最大斜率;

IFc为供试品激活补体的功能指数;

S'S为供试品曲线斜率;

S'r为参考品曲线斜率;

S'c为阴性对照曲线斜率。

18 附录Ⅹ Q 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验)

本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞E受体结合后,可阻止绵羊红细胞与淋巴细胞E受体特异性结合,根据其结合抑制率测定供试品抗人T淋巴细胞免疫球蛋白效价。

18.1 试剂

(1)淋巴细胞分离液(Ficoll's液)。

(2) Hank's液。

(3)20%胎牛血清Hank's液  试验当天取适量灭菌的Hank's液,加入经56℃、30分钟灭能及羊红细胞吸收过的胎牛血清,配成20%浓度。用0.5mol/L碳酸氢钠溶液或稀盐酸调pH值至7.2~7.4。

(4)1%羊红细胞悬液  颈静脉羊血于Alsever's液中,可保存2周。试验前取适量羊红细胞用生理氯化钠溶液洗3次,用20%胎牛血清Hank's液配成1%羊红细胞悬液。

(5)淋巴细胞悬液  取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后,缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上,以每分钟2000转离心20分钟,吸出淋巴细胞层细胞,加适量生理氯化钠溶液清洗,以每分钟1200转离心10分钟,弃上清液,沉淀加入适量20%胎牛血清Hank's液,摇匀,为淋巴细胞原液;用1%醋酸蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍,镜检计数淋巴细胞。根据计数结果,用20%胎牛血清Hank's液将淋巴细胞原液稀释成每1ml含5×106个淋巴细胞,即为淋巴细胞悬液。

18.2 供试品溶液的制备

根据供试品效价,用20%胎牛血清Hank's液将供试品稀释至几个适宜浓度。

18.3 测定法

取供试品溶液100μl,加入淋巴细胞悬液100μl,摇匀,置37℃水浴30分钟;加入1%羊红细胞悬液100μl,混匀,室温放置15分钟。以每分钟500转离心5分钟后置2~8℃过夜,每稀释度供试品溶液做2管。次日取出各管,加入当天稀释的0.2%台盼蓝溶液100μl,轻轻摇匀,镜检计数花环形成率(%)。取20%胎牛血清Hank's液100μl,加入淋巴细胞悬液100μl,自“摇匀,置37℃水浴30分钟”起,同法操作,作对照组。计算花环抑制率(%),以花环抑制率在25%以上的供试品的最高稀释倍数为花环抑制效价。

19 附录Ⅹ R 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验

本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞结合,在补体存在下破坏淋巴细胞,根据淋巴细胞死亡率测定供试品抗人T细胞免疫球蛋白效价。

19.1 试剂

(1)淋巴细胞分离液(Ficoll's液)。

(2) Hank's液。

(3)20%胎牛斑清Hank's液  试验当天取适量经消毒保存的Hank's液,加入经56℃、30分钟灭能的胎牛血清,配成20%浓度。用0.5mol/L碳酸氢钠溶液或稀盐酸调pH值至7.2~7.4。

(4)淋巴细胞悬液  取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后,缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上,以每分钟2000转离心20分钟,吸出淋巴细胞层细胞,加适量生理氯化钠溶液清洗,以每分钟1200转离心10分钟,弃上清液,沉淀加入适量20%胎牛血清Hank's液,摇匀,为淋巴细胞原液;用1%醋酸蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍,镜检计数淋巴细胞。根据计数结果,用20%胎牛斑清Hank's液将淋巴细胞原液稀释成每1ml含5×106个淋巴细胞,即为淋巴细胞悬液。

(5)补体  采用正常家兔血清。作补体用的兔血清应对试验用的靶细胞无明显的毒性,因此家兔血清要预先进行选择,方法如下:取淋巴细胞悬液0.05ml,加1:5稀释的家兔血清0.05ml,置37℃、1小时后,加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟后镜检计数淋巴细胞,死亡细胞率在10%以下者方可作补体用。

(6)0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液。

(7)2.5%戊二醛溶液(用Hank's液稀释)。

19.2 供试品溶液的制备

根据供试品效价,用20%胎牛血清Hank's液将供试品稀释至几个适宜浓度。

19.3 阳性对照溶液的制备

将经人T淋巴细胞免疫猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后,用生理氯化钠溶液稀释10倍。

19.4 阴性对照溶液的制备

将正常猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后,用生理氯化钠溶液稀释10倍。

19.5 测定法

取供试品溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,置37℃、1小时,加1:5稀释的家兔血清0.05ml,置37℃、30分钟后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟,立即镜检计数淋巴细胞,计算死亡细胞率,一般数100个淋巴细胞。取阳性对照溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,自“置37℃、1小时”起,同法操作,作阳性对照。取阴性对照溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,自“置37℃、1小时”起,同法操作,作阴性对照。

19.6 结果判定

阳性对照组的死亡淋巴细胞率大于20%,且阴性对照组的死亡淋巴细胞率小于10%,试验成立。以(+)为判定终点,出现(+)供试品的最高稀释度为该供试品的淋巴细胞毒效价。

19.7 【附注】

(1)试验组死亡淋巴细胞率

小于10%(-)

41%~60%(++)

10%~20%(±)

61%~80%(+++)

21%~40%(+)

不低于81%(++++)

(2)如供试品较多或来不及看结果时,为避免试验误差,可在抗原、抗体、补体作用后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟后,立即加2.5%戊二醛溶液0.05ml,留待适当时候镜检;或先加2.5%戊二醛溶液0.05ml,室温放置10分钟后,加入0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃,5分钟后留待适当时候镜检。

20 附录Ⅹ S 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法

本法系以酶联免疫法测定供试品中的甲型肝炎病毒抗原含量,并以参比疫苗为标准,计算供试品的相对效力。

20.1 参比疫苗及供试品溶液制备

将参比疫苗与供试品采用适宜方法进行解离后,用相应供试品稀释液进行倍比稀释,取1:2、1:4、1:8、1:16、1:32或其他适宜5个稀释度进行测定。

20.2 测定法

用纯化的甲肝病毒抗体包被酶标板,每孔100μl,2~8℃放置过夜,然后洗板、拍干。用10%牛血清PBS溶液进行封闭,每孔200μl,37℃孵育1小时。

取已包被的酶标板,加入各稀释浓度的参比疫苗和供试品,每个稀释度加3孔,每孔100μl,37℃孵育1小时或2~8℃过夜,洗板后加酶结合物,每孔加100μl,37℃孵育1小时。

洗板后加显色液,每孔100μl,37℃孵育10~15分钟,加终止剂50μl,读取吸光度(A)。

20.3 结果计算

将测出的参比疫苗及供试品的A均值乘以1000后记录于下表。[1]

稀释度

供试品A值×1000 (S)

参比疫苗A值×1000 (T)

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

T5

T4

T3

T2

T1

S5

S4

S3

S2

S1

供试品抗原含量=参比疫苗抗原含量×antilg(V/W×lg2)

V=O.2 (T1+T2+T3+T4+T5)-0.2(S1+S2+S3+S4+S5

W=0.1(T5-T1+S5-S1)+0.05(T4-T2+S4-S2

21 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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