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2010年版药典三部附录Ⅺ

目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅺ

中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录Ⅺ

2 附录Ⅺ A 人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)

本法系将供试品免疫小鼠后,产生相应的抗体,通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性

2.1 试剂

稀释液(PBS)  量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O)溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml,混合后加水至5000ml,调pH值至7.2~8.0。

2.2 攻击毒株CVS制备

启开毒种,稀释成10-2悬液,接种10~12g小鼠,不少于8只,每只脑内接种0.03ml,连续传2~3代,选择接种4~5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织,研磨后加入含2%马血清或新生牛血清制成20%悬液,经每分钟1000转离心10分钟,取上清液病毒滴定(用10只18~20g小鼠滴定)及无菌检查符合规定后作攻击毒用。参考疫苗的稀释  参考疫苗用PBS稀释成1: 25、1: 125和1: 625等稀释度。

2.3 供试品溶液的制备

供试品用PBS做5倍系列稀释。测定法  用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12~14g小鼠16只,每只小鼠腹腔注射0.5ml,间隔1周再免疫1次。

小鼠于第一次免疫后14天,用经预先测定的含5~100 LD50的病毒量进行脑内攻击,每只0.03ml;同时将攻击毒稀释成100、10-1、10-2和10-3进行毒力滴定,每个稀释度均不少于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天,并记录死亡情况,统计第5天后死亡和呈典型狂犬病脑症状的小鼠。计算供试品和参考疫苗ED50值。

计算相对效力

式中P为供试品效价,IU/ml;

T为供试品ED50的倒数;

S为参考疫苗ED50的倒数;

dT为供试品的1次人用剂量,ml;

dS为参考疫苗的1次人用剂量,ml;

D为参考疫苗的效价,IU/ml。

2.4 【附注】

(1)动物免疫时应将疫苗保存于冰浴中。

(2)各组动物均应在同样条件下饲养。

(3)攻击毒原病毒液(100)注射的小鼠应80%以上死亡。

3 附录Ⅺ B 吸附破伤风疫苗效价测定法

本法系用破伤风毒素攻击经供试品与标准品分别免疫后的小鼠(或豚鼠),比较其存活率,计算出供试品的效价。

3.1 标准品和供试品溶液的制备

生理氯化钠溶液将破伤风类毒素标准品和供试品以适当比例稀释成3~5个稀释度(居中的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动物)。测定法  用每一稀释度的破伤风类毒素标准品和供试品溶液分别免疫体重14~16g同性别或雌雄各半NIH小鼠至少14只(或250~350g豚鼠至少10只),每只小鼠皮下注射0.5ml(或每只豚鼠皮下注射1ml)。另外10只未注射的小鼠作为对照(或另外未注射的5只豚鼠作为对照)。攻击用破伤风毒素使用0.2%明胶磷酸缓冲液稀释。免疫4周后,每只免疫小鼠皮下注射50LD50破伤风毒素0.5ml(或每只免疫豚鼠皮下注射100LD50破伤风毒素1.0ml)。对照组每只小鼠皮下注射1LD50破伤风毒素0.5ml(或对照组每只。豚鼠注射1LD50破伤风毒素1.0ml)。攻击后观察5天,每日记录结果。根据第5天存活率的剂量反应曲线,用平行线法计算结果。95%可信限应在效价的50%~200%,否则95%可信限的低限应大于相应品种中要求的效价规格

3.2 【附注】

试验成立应具备的条件;

(1)供试品的最低稀释度能保护半数以上动物;

(2)供试品的最高稀释度能保护半数以下动物;

(3)供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义;

(4)对照组动物应部分死亡而不全部死亡。

4 附录Ⅺ C 吸附白喉疫苗效价测定法

4.1 第一法  豚鼠毒素攻击法(仲裁法)

本法系用白喉毒素攻击经供试品与标准品分别免疫后的豚鼠,比较其存活率,计算出供试品的效价。

4.1.1 标准品和供试品溶液的制备

将标准品和供试品用生理氯化钠溶液按等比间隔稀释3~5个稀释度,使中间稀释度在攻毒后必须能保护约半数动物。

4.1.2 测定法

用稀释好的标准品和供试品溶液分别免疫250~350g同性别或雌雄各半豚鼠,每个稀释度至少免疫10只。另取5只不免疫豚鼠同时饲养,作为对照。

免疫4周后,每只免疫豚鼠皮下注射100LD50白喉毒素1.0ml。对照组豚鼠注射经100倍稀释之上述毒索,每只皮下注射1.0ml。攻毒后观察5天,每日记录动物死亡情况。根据第5天存活率,以标准品的效价为标准,用平行线法计算供试品的效价。95%可信限应在效价的50%~200%,否则95%可信限的低限应大于相应品种中要求的效价规格。

4.1.3 【附注】

试验成立的条件:

(1)供试品的最低稀释度能保护半数以上动物;

(2)供试品的最高稀释度能保护半数以下动物;

(3)对照组动物应部分死亡而不全部死亡;

(4)供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义。

4.2 第二法  小鼠-Vero细胞

本法系用Vero细胞法测定经供试品与标准品分别免疫后的小鼠血清中的白喉抗毒素水平,计算供试品的效价。

4.2.1 试剂

(1)适宜培养液  临用时于培养液中加入新生牛血清、3%谷氨酰胺青霉素链霉素适量,使其终浓度分别为10%、0.03%、100IU/ml和100IU/ml。用7%碳酸氢钠溶液调pH值至7.0~7.2。

(2)无Ca2+Mg2+缓冲液  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.15g,加水溶解并稀释至1000ml。

(3)0.25%胰酶溶液  称取胰酶2.5g、乙二胺四乙酸二钠0.2g,用无Ca2+、Mg2+缓冲液溶解,并稀释至1000ml,用7%碳酸氢钠溶液调pH值至7.0。

4.2.2 Vero细胞悬液的制备

将Vero细胞培养于150cm2培养瓶中,待单层细胞长满至80%~100%时,弃去上层培养液,加入0.25%胰酶溶液10ml,置37℃消化数分钟,弃去胰酶,加入10ml培养液,分散细胞进行计数,用培养液调整细胞浓度至每1ml含2.5×105个细胞。

4.2.3 标准品及供试品溶液的稀释

用生理氯化钠溶液将吸附白喉类毒素的标准品和供试品分别以2倍系列稀释法稀释成3~5个适当稀释度。

4.2.4 测定法

(1)免疫与采血  用吸附白喉类毒素标准品和供试品的每一稀释度分别免疫10~14g同性别NIH小鼠8只,每只小鼠皮下注射0.5ml。免疫5周后,采血,分离血清,56℃、30分钟灭能,于-20℃保存。

(2)阳性对照小鼠血清  用含白喉类毒素成分的疫苗免疫1批小鼠,免疫5周后采血,分离血清,56℃、30分钟灭能,分装小管,冷冻,于-20℃保存。

(3)毒素试验量测定  Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素浓度采用1/10000Lcd。

在96孔培养板中用MEM培养液将毒素做2倍系列稀释,每孔50μl,然后向各孔中加入标准白喉抗毒素(0.0001IU) 50μl,加盖,室温放置1小时后,加入Vero细胞悬液50μl,加盖,用封板膜封板,于37℃二氧化碳孵箱培养6~7天后,观察结果,使细胞死亡的最大毒素稀释度(红色)即1/10000Lcd。

1/10000Lcd的毒素量相当于1×10-4 Lf的毒素,适合本试验。

(4)抗体滴定  于96孔微量培养板中测定。

①向每孔加入50μl培养液,但A11、A12孔和H11

H12孔不加,而G11、G12孔加100μl培养液。

②取8份待检血清,分别加入A1至H1孔各50μl,横向做2倍系列稀释,直至A10和H10孔。

③将标准白喉抗毒素稀释至每1ml含0.008IU,加入A11、A12、B11和B12孔各50μl,从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至D11和D12孔。

④H11和H12孔加入阳性对照小鼠血清50μl。

⑤除G11和G12孔外,向其余各孔中加入毒素(1/10000Lcd) 50μl,轻轻转动培养板,混匀,加盖后,置室温1小时。

⑥收集Vero细胞,进行计数,并稀释成每1ml含2.5×105个细胞的悬液。

⑦室温放置1小时的培养板,每孔立即加入50μl Vera细胞悬液,加盖,用封板膜封板后,于37℃二氧化碳孵箱培养6~7天。

⑧取出培养板,根据培养液颜色变化记录结果,黄色为(+),红色(-),颜色不明显者则可用显微镜观察,如单层细胞完整无损为(+),否则记录(-)。最终结果用以2为底的指数表示,终点为变成黄色的最高稀释度孔的指数。例如变黄色的最后1孔稀释倍数是256,即为28,则结果记为8。用平行线分析法进行结果计算。供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义。95%可信限应在效价的50%~200%,否则95%可信限的低限应大于相应品种中要求的效价规格。

4.2.5 【附注】

试验要求:

(1)E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度,应出现(-),如果出现(+),则毒素量和细胞敏感度都很低,应重试;

(2)细胞孔G11、G12和阳性对照孔H11、H12都必须是(+),如出现(-),应重试;

(3)如毒素用量准确(1/10000Lcd),则A11、A12和B11、B12孔均应为(+),而C11、C12和D11、D12均应为(-),否则应重试;

(4)细胞计数应准确。

5 附录Ⅺ D 类毒素絮状单位测定法

本法系依据类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度、反应时间等条件下,可在试管中发生抗原抗体结合,产生肉眼可见的絮状凝集反应。根据抗毒素絮状反应标准品可测定供试品的絮状单位值。试剂  硼酸盐缓冲液  称取四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O) 0.5g、硼酸4.5g、氯化钠8.5g,加水溶解并稀释至1000ml。pH值为7.0~7.2。

5.1 标准品溶液的制备

精密量取白喉或破伤风抗毒素絮状反应国家标准品,用硼酸盐缓冲液准确稀释至每1ml含100Lf的溶液。

5.2 供试品溶液的制备

取供试品适量,加硼酸盐缓冲液稀释至适宜絮状单位。

5.3 测定法

精密量取每1ml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml,分别加入絮状反应管,精密量取供试品溶液1ml,快速准确加入上述各絮状反应管内,摇匀,置45~50℃水浴中,连续观察,并记录絮状出现次序和时间。再取5支絮状反应管,重复上述试验,将最先出现絮状之管放中间,前后各加两管不同量抗毒素絮状反应标准品溶液,每管间隔0.05ml,再向各管中加入供试品1ml,观察絮状出现情况。根据结果,再重复试验1次,将最先出现絮状之管放中间,前后各加两管不同量抗毒素絮状反应标准品溶液,每管间隔0.02ml,同上法观察并记录结果,以2~3次相同值为最终测定值

按下式计算:

供试品絮状单位(Lf/ml)=V×n×100式中V为最先出现絮状时使用的每1ml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液的体积,ml;

n为供试品稀释倍数。

6 附录Ⅺ E 白喉抗毒素效价测定法(家兔皮肤试验法)

本法系依据抗毒素能中和毒素的作用,将供试品与标准品进行对比试验,推算出每1ml供试品中所含抗毒素的国际单位数(IU/ml)。

6.1 试剂

稀释液(硼酸盐缓冲盐水)  称取氯化钠8.5g、硼酸4.5g、四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O) 0.5g,加水溶解并稀释至1000ml,过滤灭菌后pH值为7.0~7.2。

6.2 白喉抗毒素标准品溶液的制备

取白喉抗毒素标准品适量,稀释至每1ml含1/15IU,即与毒素等量混合后每0.1ml注射量中含1/300IU。白喉抗毒素标准品原倍溶液的一次吸取量应不低于0.5ml。

6.3 供试品溶液的制备

将供试品稀释成数个稀释度,使每1ml含抗毒素约1/15 IU,其稀释度间隔约为5%~10%。

6.4 测定法

将毒素稀释至每1ml含20个试验量(1/300L),即与抗毒素等量混合后每0.1ml注射量中含1个试验量(1/300Lr)。定量吸取稀释后的抗毒素标准品溶液及不同稀释度的供试品溶液分别加入小试管中,每管加入等量的稀释毒素溶液,混合均匀,加塞,37℃结合1小时后,立即注射。

选用体重2~3kg的健康白皮肤家兔,试验前1天用适宜方法进行背部脱毛,凡皮肤发炎或出现大量斑点现象者不应使用。每份供试品溶液注射2只家兔,每只家兔不能超过4份供试品溶液。每稀释度注射0.1ml于家兔皮内(应在近背脊两侧)。每只家兔至少应包括3个不同注射部位(前、中、后)的对照试验。标准品溶液与供试品溶液不得用同一支注射器注射。

6.5 结果判定

试验家兔于注射后48小时及72小时各观察1次,并测量反应面积。以48~72小时结果作最后判定。注射对照部位一般于48~72小时内轻度发红,其直径应为10~14mm。供试品的效价应以与多数对照的反应强度相同的最高稀释度判定之,但反应强度不得超过对照。有下列情况之一者应重试:

(1)对照反应不符合规定标准;

(2)供试品的稀释度过高或过低;

(3)反应不规则。

6.6 【附注】

毒素由国家药品检定机构提供,亦可自行制备,但应选经保存1年以上、毒力适宜的毒素。试验用的毒素须以国家药品检定机构分发的标准抗毒素准确标定其试验量(1/300Lr),并应每3个月复检1次。毒素应保存于2~8℃避光处,并加入甲苯或其他适宜防腐剂

7 附录Ⅺ F 破伤风抗毒素效价测定法(小鼠试验法)

本法系依据抗毒素能中和毒素的作用,将供试品与标准品进行对比试验,推算出每1ml供试品中所含抗毒素的国际单位数(IU/ml)。

7.1 试剂

硼酸盐缓冲盐水  称取氯化钠8.5g、硼酸4.5g、四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)0.5g,加水溶解并稀释至1000ml,过滤,灭菌后pH值为7.0~7.2。

7.2 破伤风抗毒素标准品溶液的制备

(1)破伤风抗毒素标准品的稀释  抗毒素标准品用硼酸盐缓冲盐水稀释至每1ml含0.5IU,即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中含1/10IU。抗毒素标准品原倍溶液的1次吸取量应不低于0.5ml。

(2)破伤风毒素的稀释  毒素用硼酸盐缓冲盐水稀释至每1ml含5个试验量(1/10L+),即与抗毒素等量混合后每0.4ml注射量中含1个试验量(1/10L+)。试验用的毒素须以国家药品检定机构颁发的抗毒素标准品准确标定其试验量(1/10L+),并须每3个月复检1次。供试品溶液的制备  用硼酸盐缓冲盐水将供试品稀释成数个稀释度,使每1ml含抗毒素约0.5IU,即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中含抗毒素约1/10IU。稀释度的闻隔约为5%。

7.3 测定法

定量吸取稀释后的抗毒素标准品溶液及不同稀释度的供试品溶液,分别加入小试管中,每管加入等量的稀释毒素溶液,混合均匀,加塞,37℃结合1小时后,立即注射。

于17~19g小鼠腹部或大腿根都皮下注射0.4ml,应注意勿使注射液流出,标准品及供试品的每个稀释度各注射小鼠至少3只。标准品溶液与供试品溶液不得用同一支注射器注射。同一供试品的不同稀释度溶液可用同一支注射器注射。由高稀释度向低稀释度依次注射。在更换稀释度时应用下一稀释度溶液洗2~3次。每日上、下午至少观察试验小鼠1次,连续5天,并记录其发病及死亡情况。

7.4 结果判定

对照小鼠应于72~120小时内全部死亡。供试品的效价为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重者的最高稀释度。

有下列情况之一者应重试:

(1)供试品的稀释度过高或过低;

(2)对照试验小鼠在72小时前或120小时后死亡;

(3)死亡不规则以及在同一稀释度的小鼠中有2只以上属非特异死亡。

7.5 【附注】

使用干燥毒素时,须精密称定,每次称取量应不低于10mg。毒素溶解后应一次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中,亦可用干燥毒素制成液体毒素,即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解,与中性甘油(经116℃、10分钟灭菌)等量混合,每1ml至少含20个试验量。毒素应保存于2~8℃避光处。

8 附录Ⅺ G 气性坏疽抗毒素效价测定法(小鼠试验法)

本法依据抗毒素能中和毒素的作用,将供试品与标准品做系列稀释,分别与相应毒素结合,注入小鼠体内,在规定的时间内,比较小鼠存活和死亡情况,以测定供试品效价。

8.1 试剂

(1)稀释液  称取氯化钠8.5g、硼酸4.5g、四硼酸钠(Na2B4O7·H2O)0.5g,用水溶解并稀释至1000ml,过滤。灭菌后pH值应为7.0~7.2。

(2)气性坏疽毒素溶液  由国家药品检定机构提供,亦可自备。试验用的气性坏疽毒素须以国家药品检定机构分发的气性坏疽抗毒素标准品准确标定其试验量(见测定参数表),并每3个月复检1次。使用前将毒素用稀释液稀释至每1ml含5个(水肿型为20个)毒素试验量。气性坏疽抗毒素标准品溶液的制备  气性坏疽(产气荚膜、水肿、败毒、溶组织)抗毒素标准品由国家药品检定机构提供,于2~8℃处避光保存。使用时,将气性坏疽抗毒素标准品溶液用稀释液稀释至每1ml含测定参数表所示效价。气性坏疽抗毒素标准品原倍溶液的1次吸取量应不低于0.5ml。

8.2 供试品溶液的制备

将供试品用稀释液稀释成数个稀释度,使每1ml约含5个试验量(水肿型为20个试验量)。各稀释度之间的间隔约为5%~10%。

8.3 测定法

精密量取气性坏疽抗毒素标准品溶液0.8ml、1.0ml、1.2ml分别置小试管中,按管序分别补加稀释液0.7ml、0.5ml、0.3ml。精密量取不同稀释度的供试品溶液各1.0ml分别加入小试管中,每管补加稀释液0.5ml(可在抗毒素之前加入)。以上各管分别加入气性坏疽毒素溶液1.0ml(水肿型为0.5ml),混合均匀,加塞,20~25℃结合1个小时,按测定参数表所示剂量与途径,立即注射17~19g小鼠。每稀释度注射小鼠4只。结果判定  每天上、下午各观察试验动物1次,并记录发病及死亡情况,连续3天。标准品组动物在3天内,注射气性坏疽抗毒素量最少(即0.8ml)的4只动物中至少应有2只以上死亡。对比标准品组与供试品组动物死亡情况,推算供试品的效价。

有下列情况之一者应重试:

(1)标准品组动物在3天内全部死亡或者全无死亡,或者注射气性坏疽抗毒素量最少的4只动物死亡不足半数,注射气性坏疽抗毒素量最多的4只动物死亡超过半数;

(2)供试品组动物在3天内全部死亡或者全无死亡;

(3)动物死亡数极不规则,以致无法进行判定;

(4)每稀释度注射的动物中有2只以上属非特异死亡。

气性坏疽抗毒素效价测定参数表

稀释

混合

注射

抗毒素种类

毒素试验量

抗毒素

/IU·ml-1

毒素试

验量/ml

抗毒素

/ml

毒素

/ml

稀释液/ml

剂量

/ml

抗毒素

/IU

毒素试验量

动物

/只

途径

产气荚膜

败毒

溶组织

水肿

1/5L+

L+

1/2L+

1/50L+

1.0

5.0

2.5

0.2

5

5

5

20

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0.5

0.5

. 0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.2

1/5

1

1/2

1/50

1

1

1

1

4

4

4

4

静脉

静脉

静脉

肌内

8.4 【附注】

(1)自备气性坏疽毒素的制法(包括菌种培养基培养条件及干燥方法等)应与国家药品检定机构分发者相同。

(2)使用干燥气性坏疽毒素时,须精密称定,每次称取量应不低于10mg,溶解后应1次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中,亦可用干燥毒素制成液体毒素,即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解,与中性甘油(经116℃、10分钟灭菌)等量混合,每1ml至少含50个试验量。毒素应保存于2~8℃避光处。

9 附录Ⅺ H 肉毒抗毒素效价测定法(小鼠试验法)

本法系依据抗毒素能中和毒素的作用,将供试品与标准品做系列稀释,分别与肉毒毒素结合后,注入小鼠体内,在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况,以测定供试品效价。

9.1 试剂

稀释液  称取磷酸二氢钾0.7g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.4g、氯化钠6.8g,用注射用水溶解并稀释至1000ml,加明胶2.0g,溶解后过滤。灭菌后pH值应为6.2~6.8。

9.2 肉毒抗毒素标准品溶液的制备

将肉毒抗毒素标准品用生理氯化钠溶液溶解后,与中性甘油(经116℃、10分钟灭菌)等量混合,稀释至一定浓度,于2~8℃避光处保存。使用前,将肉毒抗毒素标准品溶液用稀释液稀释至每1ml含效价如测定参数表所示。肉毒抗毒素标准品原倍溶液的1次吸取量应不低于0.5ml。

肉毒抗毒素效价测定参数表

稀释

混合

注射

抗毒素

种类

毒素试

验量

抗毒素

/IU·ml-1

毒素试

验量/ml

抗毒素

/ml

试验毒

素/ml

稀释液

/ml

剂量

/ml

抗毒素

/IU

毒素试

验量

动物

/只

途径

A

B

C

D

E

F

1/5L+

1/10L+

L+

L+

1/50L+

1/20L+

1.0

0.5

5.0

5.0

0.1

0.25

5

5

5

5

5

5

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

1/5

1/10

1

1

1/50

1/20

1

1

1

1

1

1

4

4

4

4

4

4

腹腔

腹腔

腹腔

腹腔

腹腔

腹腔

9.3 肉毒毒素溶液的制备

肉毒毒素由国家药品检定机构提供,亦可自备。试验用的肉毒毒素须以国家药品检定机构分发的肉毒抗毒素标准品准确标定其试验量(见测定参数表),并每3个月复检1次。使用前,将肉毒毒素用稀释液稀释至每1ml含5个毒素试验量。

9.4 供试品溶液的制备

供试品用稀释液稀释成数个稀释度,使每1ml约含测定参数表所示单位。稀释度之间隔约为5%~10%。

9.5 测定法

精密量取肉毒抗毒素标准品溶液0.8ml、1.0ml、1.2ml分别加入小试管中,再依次分别补加稀释液0.7ml、0.5ml、0.3ml。精密量取不同稀释度的供试品溶液各1.0ml分别加入小试管中,每管补加稀释液0.5ml。以上各管分别加入肉毒毒素稀释液1.0ml,混合均匀,加塞,37℃结合45分钟,按测定参数表所示剂量与途径,立即注射体重14~16g小鼠,每稀释度注射小鼠4只。

9.6 结果判定

注射后,每天上、下午各观察试验动物1次,并记录发病及死亡情况,连续4天。以标准品组动物50%死亡终点比较供试品组动物的50%保护终点,推算供试品的效价。

有下列情况之一者应重试:

(1)标准品组动物无死亡或全死亡,或死亡极不规律而无法计算50%死亡终点;

(2)供试品组动物无死亡或全死亡,或死亡极不规律而无法计算50%保护终点;

(3)每稀释度注射的动物中有2只以上属非特异死亡。

9.7 【附注】

(1)自备毒素的制法(包括菌种、培养基、培养条件及干燥方法等)应与国家药品检定机构分发者相同。

(2)使用干燥毒素时,须精密称定,每次称量应不低于10mg,溶解后应1次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中,亦可用干燥毒素制成液体毒素,即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解,与中性甘油(经116℃、10分钟灭菌)等量混合,每1ml至少含20个试验量。毒素应保存于2~8℃避光处。

10 附录Ⅺ I 抗蛇毒血清效价测定法(小鼠试验法)

本法系依据抗蛇毒血清能中和蛇毒的作用,将供试品与标准品做系列稀释,分别与定量蛇毒相混合,注射小鼠后,比较标准品组和供试品组的小鼠死亡时间和数量,计算出供试品的效价。

10.1 试剂

稀释液  称取氯化钠8.5g、硼酸4.5g、四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O) 0.5g,用注射用水溶解并稀释至1000ml,过滤,灭菌后pH值应为7.0~7.2。

10.2 抗蛇毒血清标准品溶液的制备

将抗蛇毒血清标准品用稀释液稀释至每1ml含5U(抗银环蛇、抗蝮蛇毒血清)、5IU(抗眼镜蛇毒血清)或10U(抗五步蛇毒血清),即与5个相应蛇毒试验量混合后每0.4ml注射量分别含相应抗蛇毒血清效价1U或2U。

10.3 蛇毒溶液的制备

蛇毒须以国家药品检定机构分发的抗蛇毒血清标准品准确标定其试验量(蝮蛇眼镜蛇及银环蛇1个L+,五步蛇2个L+),将蛇毒稀释至其5个试验量不高于0.8ml。即在与抗蛇毒血清混合后,补加稀释液至2ml时,每0.4ml注射量中含1个试验量。

10.4 供试品溶液的制备

将供试品稀释成数个稀释度,使每1ml含抗蝮蛇、抗眼镜蛇或抗银环蛇毒血清效价约5U;抗五步蛇毒血清效价约10U。各稀释度间隔5%~10%。

10.5 测定法

量取不同稀释度供试品溶液各1.0ml、抗蛇毒血清标准品溶液1ml作为对照①、抗蛇毒血清标准品溶液1.2ml作为对照②,将上述抗蛇毒血清分别置小试管中,每管加入5个试验量与供试品溶液相应的蛇毒溶液,补加稀释液至2ml(即供试品每0.4ml注射量中含1个试验量或2个试验量),混合均匀,加塞,置37℃结合45分钟后立即注射小鼠。

将每个稀释度的供试品溶液、对照①及对照②各注射体重18~20g小鼠4只,每只腹腔注射0.4ml。

10.6 结果判定

每日观察1次试验小鼠,观察48~72小时,并记录发病及死亡情况。对照①小鼠死亡不低于50%,对照②小鼠应比对照①死亡晚、死亡只数少或不死亡。供试品溶液之效价为与对照①小鼠死亡情况(时间、数量)相同之最高稀释度。

试验小鼠死亡情况发生倒置或对照不成立,应重试。

10.7 【附注】

(1)注射动物要做到量准、部位准,同时要防止注射液流出。

(2)使用干燥毒素时,须精密称定,每次称量应不低于5mg,溶解后应在3天内(保存于2~8℃)用完。干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中,亦可将冻干蛇毒配成液体蛇毒,即将蛇毒复溶后与中性甘油(116℃、10分钟灭菌)等量混合。每1ml至少含50个试验量,保存于2~8℃避光处。

11 附录Ⅺ J 狂犬病免疫球蛋白效价测定法

11.1 第一法  小鼠中和试验法(仲裁法)

本法系依据供试品中狂犬病免疫球蛋白能中和狂犬病病毒的作用,将供试品和标准品做系列稀释,分别与狂犬病病毒悬液混合,小鼠脑内注射,在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况,以测定供试品效价。

11.1.1 试剂

(1)磷酸盐缓冲液(PBS)  称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 1.44g、氯化钠8.0g,加水溶解并稀释至1000ml,用氢氧化钠调pH值至7.2~8.0。

(2)2%新生牛血清磷酸盐缓冲液  量取PBS 98ml,加入2ml灭能新生牛血清。临用前配制。

(3) 20%新生牛血清磷酸盐缓冲液  量取PBS 80ml,加入20ml灭能新生牛血清。临用前配制。

11.1.2 中和用病毒悬液的制备

(1)病毒悬液的制备  取CVS毒种(一般为冻干毒种)制成10-2悬液,制法见本法(2)项,脑内接种体重10~12g小鼠每只0.03ml,待发病后取鼠脑再制成10-2悬液,接种于小鼠脑内进行传代,一般传2~3代。选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液,按0.5ml分装安瓿,冻干后真空封口,制成冻干中和用病毒,-30℃冻存待用;或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%新生牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液,以每分钟2000转离心20分钟,取上清液混匀后分装小管,-70℃冻存待用。

(2)病毒悬液毒力的预测

①冻干病毒的预测  取含20%脑悬液的冻干病毒,启开后加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液1.0ml,吹打均匀后加入4.0ml 2%新生牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀,以每分钟1500转离心10分钟,取上清液与等量的2%新生牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10-2悬液,然后再稀释至10-3、10-4、10-5、10-6,从10-6~10-2的稀释液中各取0.5ml置5个小管内,每管再加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml,置37℃水浴1小时。用体重10~12g小鼠30只,分成5组,每组6只,用经37℃作用的10-6~10-2病毒悬液接种小鼠,每个稀释度接种6只小鼠,每只小鼠脑内接种0.03ml,每天观察小鼠发病死亡情况,观察14天,接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50

②-70℃冻存病毒的预测  取含10%脑悬液的冰冻病毒,融化后即为10-1悬液,然后再稀释至10-2~10-7。从10-7~10-3各取0.5ml加至5个小管内,每管再加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml,置37℃水浴1小时。用体重10~12g小鼠30只,分成5组,每组6只,用经37℃作用的10-7~10-3病毒悬液接种小鼠,每个稀释度接种小鼠6只,每只小鼠脑内接种0.03ml,每天观察小鼠发病死亡情况,观察14天。接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50

(3)中和用病毒悬液的制备  按病毒悬液预测的100LD50的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数,用于小鼠中和试验。要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的病毒量在32~320LD50之间。

狂犬病免疫球蛋白标准品溶液的制备  由国家药品检定机构提供,或用经国家药品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。

11.1.3 供试品溶液的制备

用2%新生牛血清磷酸盐缓冲液将供试品做2倍稀释,一般可采用1: 800、1:1600、…、1:102400,但可根据供试品实际效价适当降低或提高最低稀释倍数,如采用上述8个稀释倍数,则按稀释液2.7ml加入供试品0.3ml作为1:10供试品溶液,然后再用稀释液3.5ml加入混匀的1:10的供试品溶液0.5ml作为1:80供试品溶液,再按稀释液2.7ml加入1:80的供试品溶液0.3ml作为1:800供试品溶液(1)。再按0.5ml加0.5ml做倍比稀释制备供试品溶液(2)~(8),它们的稀释倍数依次为1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200和1:102400.

11.1.4 测定法

取8个稀释度的供试品溶液(1)~(8)各0.5ml置8支小试管中,另取8个稀释度的标准品溶液各0.5ml置8支小试管中,共16支小试管,分别加入中和用病毒悬液0.5ml,置37℃水浴1小时,供注射小鼠用。另用相同体重的小鼠测定中和用病毒悬液的实际LD50,其方法可将中和用病毒悬液作为原倍再稀释100、10-1、10-2、10-3共4个稀释度,以上4个稀释度各加入0.5ml于小管内,每管再加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml,同样置37℃水浴1小时作为中和病毒对照。将已中和的供试品和标准品的不同稀释度的悬液以及病毒对照分别接种小鼠,供试品和标准品按从浓到稀的稀释度接种小鼠,而病毒对照则按从稀到浓的稀释度接种小鼠。小鼠体重10~12g,每只小鼠脑内接种0.03ml。每稀释度注射6只小鼠。

每天记录小鼠的发病死亡情况,共观察14天,接种后4天内死亡的小鼠作为非特异性死亡计。

式中  B1为供试品ED50的倒数;

B2为标准品ED50的倒数;

D为标准品的国际单位,IU/ml。

11.2 第二法  快速荧光抑制试验法

本法系依据供试品中狂犬病免疫球蛋白能中和狂犬病病毒的作用,将供试品和标准品做系列稀释,分别与狂犬病病毒悬液混合,感染敏感细胞,在规定的时间内用荧光抗体染色并观察荧光灶减少的情况,以测定供试品效价。

11.2.1 试剂

(1)含5%新生牛血清的DMEM细胞培养基取含5%新生牛血清的DMEM细胞培养基,加入抗生素,使其终浓度为100U/ml抗生素,并加入谷氨酰胺,使其终浓度为0.03%,临用前配制并按DMEM说明书要求加入适量NaHCO3调pH值至7.6。

(2)含10%新生牛血清的DMEM细胞培养基  取含10%新生牛血清的DMEM细胞培养基,加入抗生素,使其终浓度为100U/ml抗生素,并加入谷氨酰胺,使其终浓度为0.03%,临用前配制并按DMEM说明书要求加入适量NaHCO3调pH值至7.6。

(3)磷酸盐缓冲液(PBS)  称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)1.44g、氯化钠8g,加水溶解并稀释至1000ml,用氢氧化钠调pH值至7.2。临用前配制。

(4)80%冷丙酮  量取80ml丙酮,加入0.1mol/LPBS (pH7.6)20ml,混匀后密封,于4℃保存。

(5)80%甘油  量取80ml甘油,加入20ml水中,混匀,加盖后于4℃保存。

(6)0.25%胰蛋白酶-EDTA。

(7) FITC标记的狂犬病病毒核蛋白抗体  按使用说明书要求稀释到工作浓度。

11.2.2 中和用病毒的制备

(1)病毒悬液的制备  取CVS-11毒种(一般为冻干毒种)做适当稀释,以0.1MOI的感染量接种生长良好的BSR细胞,于37℃、5%二氧化碳条件下培养1天后转入34℃继续培养,2天后收集培养上清,于4℃以每分钟4000转离心10分钟去除细胞碎片,取上清液加入10%新生牛血清,混匀后分装小管,-70℃以下冻存备用。病毒液的预滴定:取冻存的病毒悬液1支,经流水速融后,在24孔培养板上从1:5开始做5倍系列稀释,取100μl病毒液加入400μl含10%灭能新生牛血清的DMEM培养液中,充分混匀后,每个稀释度取50μl转移至96孔培养板,每个稀释度平行做2份,每孔再加入5×106/ml的BSR细胞悬液50μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。培养结束后弃上清,PBS洗1遍,再加入80%冷丙酮,每孔50μl,4℃固定30分钟,或-30℃固定10分钟,弃丙酮,待挥发干燥后每孔加入50μl工作浓度的FITC标记的狂犬病病毒核蛋白抗体染色,于37℃孵育30分钟,用PBS洗3遍,甩干,每孔加80%甘油50μl,于荧光显微镜下观察;计数每孔中的荧光灶数,取每孔荧光灶数在30以下的孔,记录相邻4孔荧光灶数,取其平均值,计算如下:

病毒滴度(FFU/ml)=(最高稀释倍数孔荧光灶平均值×5+相邻孔稀释倍数较低的荧光灶平均值)/2×稀释倍数较低孔病毒稀释倍数×20

(2)中和用病毒液的制备  取病毒悬液1支,按病毒液的预滴定同法操作。在荧光显微镜下计数每孔中的荧光灶比例,以80%~95%的细胞被病毒感染的病毒稀释度为中和试验用病毒稀释度。

取冻存的病毒悬液1支,经流水融化后,用含5%灭能新生牛血清的DMEM培养液将病毒稀释至中和试验用病毒稀释度,置冰浴备用。

11.2.3 狂犬病免疫球蛋白标准品溶液的制备

狂犬病免疫球蛋白标准品由国家药品检定机构提供,或用经国家药品检定机构标定的工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。用含10%灭能新生牛血清的DMEM培养液将狂犬病免疫球蛋白标准品做3倍系列稀释,即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液,取50μl供试品加入其中,成为1:3稀释度,充分混合后,吸取50μl加入下一孔100μl培养液中,成为1:9稀释度,如此系列稀释若干孔至适宜稀释度。

11.2.4 供试品溶液的制备

供试品(血清样品应预先经56℃、30分钟灭能)用含10%[1]灭能新生牛血清的DMEM培养液做3倍系列稀释,即在96孔培养板中每孔预先加,入100μl培养液,取50μl供试品加入其中,即为1:3稀释度,充分混合后,吸取50μl加入下一孔100μl培养液中,成为1:9稀释度,如此系列稀释若干孔至适宜稀释度,最后一孔中50μl弃去[1]

11.2.5 测定法

将稀释后的标准品及供试品各孔中加人中和用病毒,50μl/孔[1],同时设正常细胞对照孔[1](只加100μl DMEM于孔中),以及中和用病毒对照孔(含5%灭能新生牛血清的DMEM 100μl[1],加入中和用病毒50μl),混匀后置37℃中和1小时,每孔加入1×106个/ml的BSR细胞悬液50μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。待培养结束吸干培养液,每孔中加入PBS 100μl清洗并吸干后,每孔加入预冷至4℃的[1]80%冷丙酮50μl,4℃固定30分钟,或-30℃固定10分钟,弃丙酮,待挥发干燥后加入工作浓度的荧光标记狂犬病病毒核蛋白抗体,50μl/孔,37℃孵育30分钟,弃去液体,用PBS洗板2~3次,甩干,每孔加入80%甘油50μl,荧光显微镜下观察。计算公式如下:

[1]

式中A为低于50%荧光灶比例[1]的标准品稀释度;

B为标准品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比;

C为标准品高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比;

n1为标准品稀释倍数。

[1]

式中E为低于50%荧光灶比例的供试品稀释度;[1]

F为供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比;

G为供试品高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比;

n2为供试品稀释倍数。

供试品效价(IU/ml) =10(J-K)×L

式中J为标准品lgED50

K为供试品lgED50

L为标准品的效价,IU/ml。

11.3 【附注】

(1)中和用病毒滴度不得小于106FFU/ml。

(2)病毒稀释时,应尽可能在冰浴中进行。

(3)病毒对照孔应有80%~95%细胞被荧光着色,细胞对照孔应无荧光,试验方可成立。

12 附录Ⅺ K IgG含量测定法(紫外-可见分光光度法

本法系依据免疫球蛋白G (IgG)与相应的抗体特异性结合后,在适宜的电解质、温度、pH条件下,产生凝集反应,形成抗原抗体复合物,根据供试品的吸光度求出供试品中IgG的含量。

12.1 试剂

(1)缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠9g、聚乙二醇6000 50g、牛血清白蛋白(BSA) 1g、叠氮钠(NaN3) 1g,加水溶解,用1.0mol/L盐酸调pH值至7.4,加水稀释至1000ml。

(2)抗人IgG血清  按说明书要求将冻干抗人IgG血清复溶,按标示效价取一定量抗人IgG血清,加缓冲液稀释至抗体最终效价为1:4(例如抗人IgG血清效价为1:100,量取原液2ml加抗体缓冲液48ml),充分混匀,0.45μm膜过滤。4℃保存备用。

12.2 IgG标准品溶液的制备

用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每1ml含0.2~6.0mg范围内做适当的系列稀释(通常做5个稀释度)。

12.3 供试品溶液的制备

用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释度,其IgG含量均应在标准曲线范围内。

12.4 测定法

取供试品溶液10μl,加入已预热至37℃的抗体液1ml,混匀,每个稀释度做2管,置37℃水浴中保温1小时,充分混匀,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典三部附录Ⅱ A),在波长340nm处分别测定吸光度。

用IgG标准品溶液10μl替代供试品溶液,同法操作。计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值。以标准品溶液的IgG含量的对数对其相应的吸光度的对数作直线回归,求得直线回归方程,相关系数应不低于0.99,然后将供试品溶液吸光度的对数值代入直线回归方程,求得值的反对数,再乘以稀释倍数,求取每1ml供试品溶液IgG含量,再由供试品各稀释度IgG含量求平均值,即为供试品IgG含量(g/L)。

12.5 【附注】

(1)全部反应管必须在10分钟内测量完毕。

(2)设置紫外分光光度计狭缝宽度(Slit  Width)为2nm。

(3)每次测定可根据供试品IgG含量,适当调整标准品溶液中IgG含量范围。

13 附录Ⅺ L 猴体神经毒力试验

本法用于脊髓灰质炎减毒活疫苗检定。

应使用体重1.5kg以上的健康猕猴,猕猴血清经1:4稀释后应证明不含同型别病毒中和抗体。试验用猕猴必须经选择和检疫,并未做过其他试验,其隔离检疫应不少于6周,应无结核、B病毒感染及其他急性传染病,血清中无泡沫病毒。凡有严重化脓灶、赘生物以及明显的肝肾病理改变者不得用于试验,可采用脊髓注射方法或脑内注射方法。

13.1 脊髓法

13.1.1 (1)猕猴的数量

猴体试验必须设立参考品。评价Ⅰ、Ⅱ型供试品及其参考品最少应各使用11只有效猕猴,评价Ⅲ型供试品应至少使用18只有效猕猴。猕猴的大小和性别应随机分配到各试验组。同型参考品可用于测试1批以上疫苗。

有效猕猴系指脊髓灰质炎病毒引起中枢神经系统的特异性神经元损伤的猕猴。

供试品组有效猕猴不足时,允许补足,但参考品组应同时补充相同数量的猕猴。如需补足参考品组有效猕猴,则供试品组也须同时补充相同数量猕猴。如试验需要2个工作日,则每1个工作日用供试品和同型参考品接种的猕猴只数应相等。为了保证有效猕猴只数,通常要相应地增加接种猕猴只数。

13.1.2 (2)供试品和参考品的病毒滴度

供试品和参考品的病毒含量应调整到尽可能接近,每只猕猴于腰髓第一、二椎间隙注射0.1ml(病毒含量6.5~7.5lgCCID50/ml),仅用1个病毒浓度接种动物。

13.1.3 (3)检查法

金部猕猴应观察17~22天。在接种24小时后死亡猕猴应做尸体解剖,检查是否系因脊髓灰质炎引起的死亡。因其他原因死亡的猕猴在判定时可以剔除。在观察期内存活的猕猴数不低于80%时,试验成立。呈濒死状态或严重麻痹的猕猴应处死进行尸检。

每只猕猴取中枢神经系统切片进行组织学检查。切片厚度为10~15μm,没食子蓝染色检查切片数如下:腰膨大12个切面;

颈膨大10个切面;延髓2个切面;桥脑和小脑各1个切面;

中脑1个切面;

大脑皮层左右侧和丘脑各1个切面。

应由同一人员统一采用4级计分法判断其病变严重程度:

1级  仅有细胞浸润(这不足以认为是有效猕猴);2级  细胞浸润伴有少量的神经元损害;

3级  细胞浸润伴有广泛的神经元损害;

4级  大量的神经元损害,伴有或无细胞浸润。

切片中有神经元损害,但未见针迹者应视为有效猕猴。切片中由外伤引起的损害,而又无特异的病理改变则不视为有效猕猴。

严重程度的分值是由腰髓,颈髓和脑组织切片的整个切片的计分累计而成的。每只有效猕猴的病变分值(LS)为:

再计算每组有效猕猴的平均分值。

参考品的平均病变分值在上限与下限之间时,才能根据C1、C2、C3值判定疫苗合格与否。判定标准如下:疫苗的平均病变分值( test)与参考品的平均病变分值( ref)相比较

合格  testref<C1

       不合格  testref>C2

       重试Ⅰ 1testref<C2(仅限1次)

重试Ⅱ  同一次试验中,疫苗组平均分值与参考组平均分值之差小于C1时,而疫苗组中如单只猕猴最高分值等于或高于2.5,并大于参考组单只猕猴最高分值的2倍时,本批疫苗应重试。

重试合格

(  (test1+ttest2) (refl+ref2))/2<C3

重试不合格

(  (test1+test2) (ref1+ref2)/2>C3

13.2 脑内法

取健康猕猴20只。麻醉后在两侧视丘分别注入0.5ml供试品(应不低于7.0lgCCID50/ml)及10-1供试品各10只,观察21天,到期存活动物数应不低于80%,有效猕猴数应不低于16只,试验有效,否则应补足。注射后48小时内死亡或出现非特异性麻痹症状者剔除不计,中途死亡及到期处死动物,做中枢神经系统病理组织学检查,判定标准如下。

13.2.1 (1)合格标准

凡符合下列情况之一者判为合格:

①中枢神经系统无脊髓灰质炎病理组织学改变;

②有2只猕猴发生轻度及其以下病变;

③1只猕猴发生中度及其以下病变。

13.2.2 (2)不合格标准

凡符合下列情况之一者判为不合格:

①1只猕猴有中度病变,同时1只猕猴有轻度以上病变者;

②1只猕猴有重度以上病变者。

13.2.3 (3)重试标准

数个亚批疫苗合并试验结果不合格者,可以分批重试,并按上述标准判定。

14 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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