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5-HT

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1 概述

5-羟色胺又称血清素(serotonin),由色氨酸衍生,色氨酸经色氨酸羟化酶作用形成5-羟色氨酸,再经脱羧酶成为5-羟色胺。5-羟色胺是中枢神经系统传递物质,其活性部分是吲哚胺。它广泛存在于脑、血小板、胃等组织中,以脑中的含量最大,是较强的平滑肌刺激血管收缩剂。它在血小板中含量较高,血小板破裂释放后参与血管收缩等效益。2/3的5-羟色胺在肝脏硫酸葡萄糖醛酸结合后排出,或将吲哚断裂而分解;约1/3经单氨氧化酶作用氧化脱氨形成5-HLAA后从尿排出。5-HIAA是5-羟色氨酸代谢的最终产物,不具有生物活性。

2 5-HT的别名

5-羟色胺;血清素

3 5-HT的医学检查

3.1 检查名称

5-HT

3.2 分类

激素类测定 > 肾上腺素测定

3.3 5-HT的测定原理

由于一定量的组织中受体的数目是有限的,因此受体与配体的结合反应是可饱和的。若将不同浓度的放射性配体与受体膜制剂一起孵育,在反应达到平衡时,测定结合配基和游离配体的量,前者为放射性总结合量。同时在另一组相应各管内加入非标记的同一种配体以测定非专一结合量。总结合量与非专一结合量之差,即为特异性结合量。受体特异性结合量显示受体膜制剂的有限结合能力。当放射性配体(3H-5-羟色胺)达到某一浓度时,最高结合值趋于恒定。即受体与配体的结合量开始随放射性配体浓度增加而增加,当放射性配体达到一定浓度时,受体与配体的结合达到饱和,利用此原理,本实验测定5-HT(5-羟色胺)受体配体和大脑受体的结合容量(RT)及受体和配体结合的能力,用平衡解离常数Kd表示。它们的反应式如下:

式中R:受体,

L:配体;

V1:复合物RL形成速率;

V2:复合物的解离速率;

K1和K2:相应的速率常数,根据质量作用定律

若[]表示浓度,则

V1=K1[R][L]

V2=K2[RL]

当反应达到平衡时,V1=V2,即K1[R][L]=K2[RL],若以Kd代表K2/K1,则Kd的单位是浓度单位(mol/L),Kd越小表示亲和力越大。

3.4 试剂

(1)仪器:液体闪烁计数器、超速离心机、低速冷冻离心机、高速分散匀浆器、超声波粉碎仪、磁力搅拌器、恒温水浴箱(37℃)、微量加样器、69型玻璃纤维滤纸或GF/B瓦特曼玻璃纤维滤纸、多头细胞收集器、手术器械。

(2)化学试剂:Tris,AR盐酸、AR,抗坏血酸、AR,优降宁(pargyline)AR,3H-5HT、6×1012Bq/mmol、浓度3.7×107Bq/ml、放化纯度>97%,PPO,POPOP、二甲苯、AR,5-HT肌酐硫酸盐。

(3)溶液配制

①50mmol/L Tris-HCl pH7.7。

②50mmol/L,Tris-HCl溶液,含0.1%抗坏血酸和10μmol优降宁,调pH至7.2。

③10μmol/L 5-羟色胺溶液,用溶液②溶解5-HT肌酐硫酸盐,使浓度为10μmol,暗处保存备用,因在日光下极易氧化,所以要现配现用。

④放射性配体的配制:本实验使用3H-5HT作为5-HT受体的放射性配体。比活度为6×1012Bq/mmol/L,浓度为3.7×107Bq/ml。即3H-5HT599Bq/pmol,或3.7×104Bq/1μl。要求配制3H-5HT的化学浓度为242pmol/ml,根据上述要求,用微量加样器精确地吸取3H-5HT 3.92μl置于小瓶中,用氮气吹干,加入1ml溶液②摇匀备用。取20.66μl滴于滤纸上,80℃烘干1h,置于闪烁杯中,加入4ml闪烁液测量放射性,设仪器测量效率为44%,则应测得的计数为79121cpm/5pmol3H-5-羟色胺。放冰浴中备用。

⑤0.4%PPO,0.02%POPOP二甲苯闪烁液。

3.5 操作方法

(1)膜受体制备:

①脑匀浆:大鼠或小鼠断头放血,将头剪下置冰浴中,并用骨剪剪开头颅立即取出大脑,除去包膜及残血,剪碎后加入相当重量20倍体积的预冷的溶液①,用内切式高速分散器匀浆10000r/min,1min,再用超声波粉碎器匀浆60s。全部过程在冰浴中进行。

②离心:脑匀浆在1000×g离心10min,除去细胞核致密物质,用滴管小心地将上清液移至另一离心管中,再用50000×g离心10min,弃去上清液,沉淀物再用溶液①洗涤离心2次。最后所得的沉淀物为含受体的细胞膜碎片。全部操作都在0~4℃进行。

③悬液:沉淀物用溶液②悬浮,再用超声波粉碎器匀浆60s。然后用溶液②配成每毫升悬浮液中含脑组织湿重11.76mg。取0.2ml按lowry法测定其蛋白含量。放冰浴中备用。

(2)结合反应 反应总体积为2ml,试管分二部分,一部分为总结合反应管,另一部分非特异性结合反应管。

①总结合试验:按表1顺序逐项加试剂。

②非特异结合(NSB)试验:本实验以10-5mol/L的5-羟色胺所抑制的结合配体为非特异性结合。用溶液②配制200nmol/L 5-羟色胺溶液备用。按表2顺序逐项加试剂。

③温育:最后一项试剂膜受体加入后立即在混旋器上混匀,然后将管子置于恒温水浴中37℃温育10min,不停地振播,使结合反应达到平衡。

④结合配基和游离配基的分离温育结束后立即将反应管置于冰浴中终止反应。A.用两层69型玻璃纤维滤纸或GF/B玻璃纤维滤纸,以多头细胞收集器进行减压过滤,用冷的溶液①洗去未与受体结合的游离的放射性配基,可一次抽滤10管,每管用5ml溶液①洗3次,分离时间要在20s完成。分离完毕后,将滤纸置于盘内,80℃烘箱烘干1h。B.如果无多头细胞收集器,可用负压玻璃瓶逐管抽滤。这样一次不能做太多管子,因为分离时间极短。做完一批之后再做第二批。

⑤测量:将烘干的滤膜按顺序置于闪烁杯内,并加4ml闪烁液,用液体闪烁计数器测量其放射性。所得计数即为总结合配基的量。

(3)结果计算:反应体积是2ml,其中含有20mg湿重的脑组织。本实验室液体闪烁计数器测量滤纸的效率是44%。数据处理目的是计算受体与放射性配基的结合总量(RT)以及它们的Kd常数。常用的方法有Scatchard法和Hill系数法。

Scatchard作图法:

A.总结合管每管加入的3H-5-羟色胺量,测得的cpm数(复管)。一般加入的3H-5-羟色胺被受体结合的总量小于3%,即加入的3H-5-羟色胺总量(LT)>>3H-5HT结合量(B),因为F=LT-B,所以F≈LT

B.计算非特异性结合量(NSB):为了减少NSB的误差对特异结合的影响,我们先将实验得到的数据进行直线回归,然后根据方程求相应于每个总结合管的NSB期望值。这样处理后可明显减少NSB数据波动对实验结果的影响。

C.计算特异性结合(B):

B=总结合(cpm)-NSB(cpm)

D.求游离配基量(F):加入3H-5HT总量(LT)>>3H-5-羟色胺结合量(B),

∵F=LT-B ∴F≈LT

E.求B/F:

将上述各项计算综合如表3。

以B/F为纵轴,B(pmol)为横坐标作Scatehard图。

在计算器上将上表中的B(pmol/g)值输入X,B/F值输入Y,求得直线回归结果是:Y=-1.145X+29.1,r=-0.99,Kd=8.72nmol/L、BT=25.4pmol/g组织(脑)。

Hill作图:Hill作图的数据列于表4中。

表4中第一、二栏为3H-5-羟色胺加入量及其对数。第三栏取自Scatehard作图数据,Bmax=25.4pmol/g组织。第四、五栏为结合率及其对数,根据这些数据以log[3H-5-羟色胺]为X轴,为Y轴绘Hill图。经直线回归斜率=0.94,Hill系数hH=1.0。kd=9.3nmol/L。这与Scatehard分析得到的kd=8.73没有显著差异。

3.6 正常值

血清0.22~2.06μmol/L (39~361ng/ml)

3.7 化验结果临床意义

(1)升高:类癌瘤综合瘤综合征、术后倾倒综合征偏头痛、低氧症等。

(2)降低:系统性红斑狼疮SLE)、类风湿性关节炎风湿性关节炎)、混合性结缔组织病结缔组织疾病、帕金森病(震颤性麻痹)、舞蹈病、肝豆状核变性Wilson病)、精神分裂症神经衰弱等。

3.8 附注

食入大量的核桃香蕉后也可上升。

3.9 相关疾病

倾倒综合征、偏头痛、头痛、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、帕金森病、肝豆状核变性、精神分裂症、神经衰弱

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