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沉淀反应

1 拼音

chén diàn fǎn yìng

2 英文参考

precipitation

3 概述

沉淀反应是一种血清反应。沉淀反应指可溶性抗原抗体结合,形成不溶性的、可以看见的沉淀物的过程。利用沉淀反应,曾提出各种有关抗原、抗体的定性或定量方法。最简单的方法是将抗血清放入细玻璃管内,将抗原液轻轻地加于其上,短时间(1—2分钟内)内便可在界面生成白色沉淀(环状试验)。又将抗原液同抗血清以最适当比例混合,用离心法收集沉淀物而测定其数量,由此可以测知抗体量或抗原量。沉淀反应在琼脂之类的凝胶内进行,可普遍应用于检查抗原或抗体的浓度及组成的目的。

4 沉淀反应的抗原

沉淀反应的抗原可以是多糖蛋白质类脂等。同相应抗体比较,抗原的分子小,单位体积内含有的抗原量多,做定量试验时,为了不使抗原过剩,应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价习惯上将参与沉淀反应的抗原称为沉淀原,抗体称沉淀素

5 液体内沉淀试验

5.1 絮状沉淀试验

絮状沉淀试验为历史较久,又较有用的方法。该法要点是:将抗原与抗体溶液混合在一起,在电解质存在下,抗原与抗体结合,形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响,因而产生了两种最适比例的基本测定方法

5.1.1 (一)抗原稀释法

抗原稀释法(Dean-Webb法)是将可溶性抗原作一系列稀释,与恒定浓度的抗血清等量混合,置室温或37℃反应后,产生的沉淀物随抗原的变化而不同。表12-1系以牛血白蛋白为例的实验结果。

表12-1Dean-Webb定量沉淀试验

管号 抗原 抗体 总沉淀量 反应过剩物 抗原沉淀量 抗体沉淀量 沉淀中Ab/Ag
1 0.003 0.68 0.093 Ab 0.003 0.090 30.0
2 0.005 0.68 0.145 Ab 0.005 0.140 28.0
3 0.011 0.68 0.249 Ab 0.011 0.238 21.7
4 0.021 0.68 0.422 Ab 0.021 0.401 19.1
5 0.032 0.68 0.571 Ab 0.032 0.539 16.8
6 0.043 0.68 0.734 0.043 0.691 16.1
7 0.064 0.68 0.720 Ab
8 0.085 0.68 0.601 Ag
9 0.171 0.68 0.464 Ag
10 0.341 0.68 0.368 Ag

单位:mmol/L

从表12-1可以看出,1~5管为抗体过剩管,7~10管为抗原过剩管,唯第6管沉淀物最多,两者之比为16:1,即最适比。

5.1.2 (二)抗体稀释法(Ramon)法

本法采用恒定的抗原量与不同程度稀释的抗体反应,计算结果同上法,得出的是抗体结合价和最适比。

现今,为了取得抗原与抗体的最佳比例,已将以上两法相结合,即抗原和抗体同时稀释,称为棋盘格法(亦称方阵法),找出最佳配比。举例见表12-2。

表12-2方阵最适比测定

抗体稀释度 抗原稀释度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12 对照  
1/5 ++ +++ +++ ++ ±
1/10 ++ ++ ++ +++ ++
1/20 ++ ++ +++ ++
1/40 ± ++ +++ ++
1/80

“+”为沉淀物量:为最适比

从表12-2可以看出,方阵法可较正确地找出抗原与抗体的最适比。如抗体用1:40。抗原则按1:320稀释;如抗原是1:160,抗本则用1:20最为恰当。

5.2 环状沉淀试验

环状沉淀试验是Ascoli于1902年建立的,其方法是:先将抗血清加入内径1.5~2mm小玻管中,约装1/3高度,再用细长滴管沿管壁叠加抗原溶液。因抗血清蛋白浓度高,比重较抗原大,所以两液交界处可形成清晰的界面。此处抗原抗体反应生成的沉淀在一定时间内不下沉。一般在室温放置10min至数小时,在两液交界处呈现白色环状沉淀则为阳性反应。本技术的敏感度为3~20μg/ml抗原量。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。该试验主要用于鉴定微量抗原,如法医学中鉴定血迹,流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原等,亦可用于鉴定细菌多糖抗原。因该技术敏感度低,且不能作两种以上抗原的分析鉴别,现已少用。

6 凝胶内沉淀试验

最常用的凝胶为琼脂糖。由于凝胶内沉淀试验具有高度的敏感性和特异性,且设备简单、操作方便,因而得到广泛应用。

该试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散,形成浓度梯度,在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。适宜浓度的凝胶可视为一种固相的液体,水分占98%以上,凝胶形成网络,将水分固相化。抗原和抗体蛋白质在此凝胶内扩散,犹如在液体中自由运动。大分子(分子量为20万以上)物质在凝胶中扩散较慢,可利用这点识别分子量的差别。另外,由于琼脂网孔有一定的限度,抗原抗体结合后,复合物的分子量至少应在百万以上,这种超大分子则被网络在琼脂中,经盐水浸泡也只能去除游离的抗原或抗体,这对后面的分析带来极大的方便。

凝胶内沉淀试验可根据抗原与抗体反应的方式和特性,分为单向扩散试验和双向扩散试验。

6.1 单向扩散试验

本试验是在琼脂胶中混入一定量抗体,使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散,在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形成可分为试管法和平板法两种。

6.1.1 (一)试管法

该方法由Oudin于1946年报道。将血清或纯化抗体混入约50℃的0.7%琼脂糖溶液中,注入小口径试管内,待凝固后,在凝胶中面加入抗原溶液,让抗原自由扩散入凝胶内,在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光处,极易观察这种白色不透明沉淀带。

沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响。溶液内含有多种抗原,在凝胶中含有各自的抗体,扩散后形成相应的抗原抗体复合物,出现多条区带。试管上部的沉淀带表示抗原量少或者抗体量多;反之,下面的沉淀带则是抗原量大,抗体量少。另外,抗体类型也有很大区别,如用兔抗血清(R型抗体),抗体过量亦可形成复合物,因而沉淀带宽而界线不清;如用马抗血清(H型抗体),抗原或抗体过量皆不形成复合物,因而只在比例合适处形成界线清晰的沉淀物(图12-1)。

图12-1两种抗血清形成的沉淀带示意图

6.1.2 (二)平板法

此法由Mancini于1965年提出,是目前最常用的简易抗原定量技术,其要点是:将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内(约50℃),未凝固前倾注成平板,凝固后在琼脂板上打孔(一般直径约3~5mm),孔中加入抗原溶液,放室温或37℃让其向四周扩散,24~48h后可见周围出现沉淀环(图12-2)。

图12-2单向辐射状免疫扩散

上排为5个不同的参考中、下排为患者血清

下排右2为一异常病理血

由于试验中抗原向四周扩散,故又称单向辐射状免疫扩散(singleradialimmunodeffusion,SRID)。最后,测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关,但不是直线相关,而是对数关系。同时,这种沉淀还与分子量和抗散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法:

1.Mancini曲线适用于大分子抗原和长时间扩散(>48h)的结果处理。使用方格计算纸划线,扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系(图12-3)。

利用公式表示:C/d2=K

图12-3Mancini曲线

T1为1624h;T2为24~48h;T3为48h以上;可见T3为直线,T1为反抛物线

式中C=抗原浓度,d=沉淀环直径,K=常数

2.Fahey曲线这种曲线适用于小分子抗原和较短时间(24h)扩散的结果处理。使用半对数划线,浓度的对数与扩散圈直径之间呈线性关系(图12-4)。

用公式表示:log/d=K

式中C=抗原浓度(mg/d),d=沉淀环直径,K=发常数。

各种蛋白质只要符合以下3条,几乎皆可用SRID定量测定:①备有仅对某待测抗原的单价特异抗血清;②备有已知含量的标准品;③待测品含量在1.25μg/ml以上(单向扩散技术的敏感度)。现在最常用于临床检测的项目有IgGIgAIgMC3C4转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白

在检测标本的同时,用已知含量的标准抗原作5~7个稀释度,同时测量圈的大小(见图12-2)。按扩散时间(Fahey和Mancini法)的不同,取方格纸或对数纸做标准曲线图。

单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法,其重复性线性皆是可信赖的,唯敏感度稍差(不能测μg/ml以下含量)。另外,以下影响因素也应注意

1.抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高,而且还应注意存放的方法,防止效价下降。

2.标准曲线测定必须同时制作,决不可一次做成,长期应用。

3.测定时必须同时加测质控血清,以保证测量准确性。

4.有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率、但抗原性相同的两个组分。例如α重链病血清中出现的α重链和正常IgA发生反应,就形成内外两重环(图12-2)。

图12-4Fahey曲线

t1为1624h;t2为2448h;t3为48h以上可见t1为直线,t3为抛物线

5.在单向扩散试验时,有时会出现结果与真实含量不符,这主要出现在Ig测定中。如用单向克隆抗体或用骨髓抗原免疫动物获得的抗血清,都存在结合价单一的现象,若用此作为单向扩散试剂测量正常人的多态性抗原,则抗体相对过剩,使沉淀圈直径变小,测量值降低。

6.测得结果的假阳性升高现象与上面相反,如用多克隆抗体测定单克隆病M蛋白),则抗原相对过剩(单一抗原决定簇成分),致使沉淀圈呈不相关的扩大,从而造成某一成分的伪性增加。

6.2 双向扩散试验

在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散,在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线,观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系,可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。

6.2.1 (一)试管法

试管法由Oakley首先报道。先在试管中加入含抗体的琼脂,凝固后在中间加一层普通琼脂,冷却后将抗原液体加到上层。放置后,下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散,在抗原与抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。此法分析效果与Oudin法相似,在临床检验中罕用。

6.2.2 (二)平板法

平板法由Ouchterlony首先报道,是抗原抗体鉴定的最基本方法之一。该法的基本步骤是:在琼脂板上相距3~5mm打一对孔,或者打梅花孔、双排孔、三角孔等(图12-5)。在相对的孔中加入抗原或抗体,置室温或37℃18~24h后,凝胶中各自扩散的抗原和抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。根据沉淀线的形态和位置等可作如下3种分析。

1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估计沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致。沉淀线如靠近抗原孔,则指示抗体含量较大;如靠近抗体孔,则指示着抗原含量较多。不出现沉淀线则表明抗体或抗原过剩。另外,如出现多条沉淀线,则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此,可用于鉴定抗原或抗体的纯度。

图12-5双扩散各种孔型图

2.抗原或抗体相对分子量的分析抗原或抗体在琼脂内自由扩散,其速度受分子量的影响。分子量小者扩散快,反之则较慢。由于慢者扩散圈小,局部浓度较大,形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如若两者分子量相等,则形成。图12-6显示左侧沉淀线抗原分子量大于抗体,右侧沉淀线则抗体大于抗原,中间一条线则为两者相等。抗体多为IgG,分子量约15kD,未知抗原的分子量可做粗略估计。

图12-6抗原抗体相对分子量示意图

3.用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质完全相同、部分相同或完全不同。三种情况在双向扩散中表现的基本图形见图12-7。

从图12-7可以分析出,左图中两种受检抗原(Ag-a)完全相同,形成一个完全融合的沉淀线;右图中抗体为双价,两种抗原完全不同(Ag-a和Ag-c);中图的抗体为双价,两种抗原(Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位,又有不同的b和c表位,所以沉淀线呈部分融合的形状。这种技术作为抗原的分析,是目前免疫化学中最常用的鉴定技术之一。

图12-7三种扩散基本图型

4.用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度,稀释抗体;或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释,经过自由扩散,形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。

7 免疫电泳技术

免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点,一是加快了沉淀反应的速度,二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开,再分别与抗体反应,以此作更细微的分析。免疫电泳技术的种类很多,这里仅将常用的技术介绍如下。

7.1 免疫电泳

免疫电泳为区带电泳与免疫双向扩散的结合,是由Grabar和Williams(1953)首先报道的。方法是先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离开,然后与电泳方向平行在两侧开槽,加入抗血清。置室温或37℃使两者扩散,各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形沉淀线(图12-8)。根据各蛋白所处的电泳位置,可分为白蛋白区、球蛋白α1区、α2区、β区和γ区。各区带常见血浆蛋白见表12-3和图12-9。

图12-8免疫电泳扩散模式图A1b:白蛋白

表12-3血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分

ALB α1 α2 β γ
白蛋白 α1-抗胰蛋白酶 触珠蛋白 转铁蛋白 IgG
前白蛋白 α1-酸糖蛋白 铜蓝蛋白 C3a、C3b CRP
α1脂蛋白 糜蛋白酶 2-巨球蛋白 IgA、IgM、IgD纤维蛋白原、β1脂蛋白、血凝素  

图12-9血浆蛋白各区带位置示意图

PreALB:前白蛋白;HP:触珠蛋白;α1脂蛋白;ALB:白蛋白;TRF:转铁蛋白

βLIP:β脂蛋白;AAT:抗胰蛋白酶;AAG:酸糖蛋白;α2M:α2巨球蛋白

免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响。首先是抗原与抗体的比例,同其它沉淀反应一样,要预测抗体与抗原的最适比;其次是抗血清的抗体谱,一只动物的抗血清往往缺乏某些抗体,如将几只动物或几种动物的抗血清混合使用,则效果更好;电泳条件,如缓冲液、琼脂和电泳等皆可直接影响沉淀线的分辨率。对于免疫电泳的分析,更重要的是经验的积累,只有多看,多对比分析,才能作出恰当的结论。

免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面。

7.2 对流免疫电泳

对流免疫电泳实质上是定向加速度的免疫双扩散技术,其基本原理是:在琼脂板上打两排孔,左侧各孔加入待测抗原,右侧孔内放入相应抗体,抗原在阴极侧,抗体在阳极侧。通电后,带负电荷的抗原泳向阳极抗体侧,而抗体藉电渗作用流向阴极抗原侧,在两者之间或抗体的另一侧(抗原过量时)形成沉淀线(图12-10).

图12-10对流电泳结果示意图

①Ag为阳性;②Ag为弱阳性;③Ag为强阳性;④Ag为强阳性

IgG作为蛋白质在电泳中比较特殊,4个亚型有不同的表现。G3和G4与一般蛋白无异,泳向阳极;而G1和G2则因其带电荷少,受电渗的作用力大于电泳,所以被水分子携裹向阴极移动。这就形成了IgG的特殊电泳形式:一部分泳向阳极,另一部分泳向阴极,在抗体孔两侧皆有抗体存在。因此,所谓对流只是部分IgG的电渗作用造成。

7.3 火箭免疫电泳

火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验,它是由单向扩散发展起来的一项定量技术,实质上是加速度的单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔;加入待测标本后,将抗原置阴极端,用横距2~3mA/cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极,在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少,沉淀逐渐减少,形成峰状的沉淀区,状似火箭(图12-11)。抗体浓度保持不变,峰的高度与抗原量呈正比,用标本中的抗原含量。

图12-11火箭电泳图

①②③为标本;④⑤⑥为标准抗原

火箭电泳操作时应注意以下几点:

1.所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的,否则火箭形状不规则。

2.注意电泳终点时间,如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。

3.标本数量多时,电泳板应先置电泳槽上,搭桥并开启电源(电流要小)后再加样。否则易形成宽底峰形,使定量不准。

4.作IgG定量时,由于抗原和抗体的性质相同,火箭峰因电渗呈纺缍状。为了纠正这种现象,可用甲醛与IgG上的氨基结合(甲酰化),使本来带两性电荷的IgG变为只带电荷,加快了电泳速度,抵消了电渗作用,而出现伸向阳极的火箭峰。

火箭电泳作为抗原定量只能测定μg/ml以上的含量,如低于此水平则难于形成可见的沉淀峰。加入少量125I标记的标准抗原共同电泳,则可在含抗体的琼脂中形成不可见的放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度(竞争法)可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出ng/ml的抗原浓度。

7.4 免疫固定电泳

免疫固定电泳(immunofixationelectrophoresis,IFE)是Alper和Johnson(1969)推荐的一项有实用价值的电泳加沉淀反应技术。可用于各种蛋白质的鉴定。该法原理类似免疫电泳,不同之处是将血清直接加于电泳后蛋白质区带表面,或将浸有抗血清的滤纸贴于其上,抗原与对应抗体直接发生沉淀反应,形成的复合物嵌于固相支持物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去,则出现被结合固定的某种蛋白。区带电泳支持物选用滤纸、醋纤膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆可。

免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。方法是:先将患者血清或血浆在醋纤膜上或琼脂上作区带电泳(一般作6条标本),达到预定时间后取下,加抗血清,由上而下依次加抗人全血清、抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗κ轻链和抗λ轻链。必要时还可加抗Fab、抗Fc等特殊抗血清。作用30min后洗去游离蛋白质,染色后则可被固定的相应M蛋白成分。

8 免疫浊度法

经典的沉淀试验有4个缺点无法克服,即操作繁琐、敏感度低(10~100μg/ml)、时间长和难以自动化。根据抗原与抗体能在液体内快速结合的原理,70年代出现了微量免疫沉淀测定法,即免疫透射浊度测定、免疫胶乳浊度测定和免疫散射浊度测定法。这3种技术皆已常规用于临床体液蛋白的检测,并已创造出了多种自动化仪器。

免疫浊度测定的基本原理是:抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物,使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时,形成的复合物随抗原量增加而增加,反应液的浊度亦随之增加,与一系列的标准品对照,即可计算出受检物的含量。

免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种,即比浊仪测定(turbidimetermeasure)和散射比浊仪测定(nephelomitermeasure)。比浊仪测定是测量由于反射吸收或散射引起的入射光衰减,其读数以吸光度A表示。A什反映了入射光与透射光的比率(A=2-log10T,T代表浊度百分比)。散射比浊仪测定是测量入射光遇到质点(复合物)后呈一定角度散射的光量,该散射光经放大后以散射值表示。两者的比较见图12-12。

图12-12透射光和散射光测定比较

由于免疫复合物的形成有时限变化,当抗原抗体相遇后立即结合成小复合物(<19S),几分种到几小时才形成可见的复合物(>19S)。作为快速比浊测定,这种速度太慢,加入聚合剂(或促聚剂)可中速大的免疫复合物形成。目前促聚剂多用聚乙二醇(MW6000~8000),浓度约为4%。

浊度测定亦有其弱点。其一是抗原或抗体量大大过剩时易出现可溶性复合物,造成测定误差,测定单克隆蛋白时这种更易出现。其二是应维持反应管中抗体蛋白量始终过剩,这个值要预先测定,使仪器的测定范围在低于生理范围到高于正常范围之间;其三是受血脂的影响,尤其是低稀释度时,脂蛋白的小颗粒可形成浊度,使测定值假性升高。

8.1 免疫胶乳浊度测定法

在上述比浊法中,少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度,除非放置较长时间;如形成较大的复合物,则抗原和抗体用量也较大,显然不符合微量化的要求。于是发展了免疫胶乳浊度测定,其基本原理是:将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上,当遇到相应抗原时,则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过,两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少,这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比,当然也与待测抗原量呈正比。见图12-13。

图12-13载体胶乳免疫比浊原理

(a)带抗体的胶乳在波长之内可透过光线;(b)结合后,则形成光线衰减

该技术的关键在于两个方面。首先是选择适用的胶乳,其大小(直径)要稍小于波长。用500nm波长者,选择100nm颗粒较适合;用585nm波长者,则选用100~200nm颗粒为好。目前多用200nm的胶乳颗粒。其次,胶乳与抗体结合时用化学交联虽好,但失活也较严重;一般用吸附法即可。

8.2 免疫速率散射浊度测定法

速率散射比浊法(ratenephelometry)是Sternberg(1977)创建的。光沿水平轴照射时,碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射,散射光的强度与复合物的含量成正比,亦即待测抗原越多,形成的复合物也越多,散射光就越强。

速率散射比浊测定是一种抗原抗体结合的动态测定法。经典的沉淀反应皆在抗原抗体结合完成后进行复合物的定性或定量测定(终点法);若在抗原抗体反应的最高峰(约在1min内)测定其复合物形成的速率(速率法),则可达到快速、准确的目的。

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