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抗血清

1 拼音

kàng xuè qīng

2 英文参考

antiserum

3 概念

免疫血清亦称抗血清。含有抗体血清制剂。

4 抗血清的种类

免疫血清种类很多,包括抗毒素抗菌血清、抗病毒血清、抗Rh血清等。

(1)抗毒素,将类毒素多次免疫动物(常用马)后,采取动物的免疫血清,经浓缩纯化后制得。主要用于治疗细菌外毒素所致疾病。常用的有白喉抗毒素破伤风抗毒素

(2)抗菌血清,在本世纪40年代以前曾用抗肺炎、抗百日咳、抗炭疽等抗菌血清治疗有关疾病。自从磺胺类药物和抗生素大量应用后,已极少应用于临床治疗。但对一些耐药菌株引起的感染,可用抗菌血清治疗。如对绿脓杆菌引起的感染的治疗。

(3)抗病毒血清,用病毒免疫动物,取其血清精制而成。目前对病毒病的治疗尚缺乏特效药物。故在某些病毒病的早期或潜伏期,可考虑用抗病毒血清治疗。如用抗狂犬病毒血清与抗狂犬疫苗同时对被狂犬严重咬伤者进行注射,可防止狂犬病发生。生。

(4)抗Rh血清,能作用于Rh阳性(Rh 红细胞,临床上常用提纯的抗Rh球蛋白预防Rh新生儿溶血症(见Rh免疫球蛋白)。

5 抗血清的制备

5.1 动物的选择

选择合适的动物进行免疫极为重要。选择时应考虑以直几个因素:①抗原与免疫动物的种属差异越远越好;亲缘关系太近不易产生抗体应答(如兔-大鼠之间,鸡-鸭之间)。②抗血清量的需要:大动物如马、骡等可获得大量血清(一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清);但有时抗体需要是不多,选用家兔或豚鼠即可。③抗血清的要求:抗血清可分为R型和H型。H型抗血清用于沉淀反应较难掌握,因而极少应用。④抗原的选择:对蛋白质抗原,大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔。但是,在某些动物体内有类似的物质或其它原因,对这些动物免疫原性极差,如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类(如胃蛋白酶原等)对山羊等,免疫时皆不易出现抗体。这些物质有时可以用豚鼠(如胰岛素等)、火鸡、甚至猪、狗、猫等作试验免疫。⑤甾体激素免疫多用家兔;酶类免疫多用豚鼠。

5.2 免疫剂量、时间和途径

免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子大小和免疫时间。抗原需可量多,时间间隔长,剂量可适当加大。大动物抗原剂量(以蛋白抗原为准)约0.5~1mg/只,小动物约0.1~0.6mg/只。有时主观希望加强免疫效果而不适当地加大剂量,往往会弄巧成拙。因为剂量加大极易造成免疫耐受(免疫抑制)而遭失败。已有证明,几微克的蛋白质也能很好地免疫出抗血清。

免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射,一只动物注射总数约为8~10点,包括足掌及肘窝淋巴结周围,背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下,皮内易引起细胞免疫反应,对提高抗体效价有利。但皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入(因佐剂加入后粘度较大)。其他途径还有肌内、腹腔、静脉、脑内等,但较少应用。如抗原极为宝贵可采用淋巴结内微量注射法,抗原只需10~100μg;方法是先用不完全佐剂在足作基础免疫(预免疫),10~15天后可见肘窝处有肿大的淋巴结(有时在腹股沟处触及),用两手指固定好淋巴结,消毒后用微量注射器直接注射入抗原(一般不需要佐剂)。

免疫间隔时间也是重要因素,特别是首次与第二次之间更应注意。第一次免疫后,因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段,如很快接着第二次注入抗原,极易造成免疫抑制。一般以间隔10~20天为好。二次以后每次的间隔一般为7~10天,不能太长,以防刺激变弱,抗体效价不高。对于半抗原的免疫间隔则要求较长,有的报告1个月,有的长达40~50天,这是因为半抗原是小分子,难以刺激机体发生免疫反应之故。免疫的总次数多,多为5~8次。如为蛋白质抗原,第八次免疫未获得抗体,可在30~50天后再追加免疫一次;如仍不产生抗体,则应更换动物。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体,有时总时间为一年以上。

5.3 动物采血法

动物免疫3~5天后,如抗血清鉴定合格(见下节),应在末次免疫后5~7天及时采血,否则抗体将会下降。因故未及时取血,则应补充免疫一次(肌肉、腹腔或静脉内注射,不加佐剂),过5~7天取血。

1.颈动脉放血法这是最常用的方法,对家兔、山羊等动物皆可采用。在动物颈外侧做皮肤切口,拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌,将此肌钝性分离并推向后方,即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离(连同与之同行的迷走神经),用丝线将远心端结扎,近心端用止血钳夹住,另一止血钳夹住动脉迷走神经,用以固定。沿结扎处剪断血管,用固定止血钳将断端放入瓶口,慢慢打开夹持的止血钳,动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快,动物死亡也快,取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时,暂时将动脉夹住片刻,再继续放血,得血量可以多些。

另外一种慢放血法是在动脉内插入一采血器,用闭式放血。在颈动脉内插入一较粗的玻璃管,将血管与玻璃管用线扎牢,玻璃管接一橡皮管引血入瓶,也极为方便。

2.心脏采血法此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。采血技术应熟练,穿刺不准容易导致动物急性死亡。

3.静脉多次采血法家兔可用耳中央静脉,山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次,有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法,一只家兔可采百余毫升血液(用颈动脉放血最多可获70~80ml,一般只有50ml左右)。用颈静脉采集绵羊血,一次可放300ml,放血后立即回输10%葡萄糖盐水,三天后仍可采血200~300ml。动物休息一周,再加强免疫一次,又可采血二次。如此,一只羊可获1500~2000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法,每鼠得血一般不超过2ml。

抗血清的分离多采用室温自然凝固,然后放置37℃或4℃待凝块收缩。前者迅速,但得血清较少;后者时间长,有时还会出现溶血,但获得血清多,而且效价不会下跌。

抗血清分出后是否要经56℃30min灭活有两种不同意见。一种认为血清中有许多活性酶,特别是球蛋白的降解酶,如不清除,血清存放过程中将导致抗体效价下降。另外的意见认为,这种自然降解是微不足道的,56加温后,有些球蛋白会发生热变性或者热聚合。含这种聚合大分子蛋白的抗血清用于免疫浊度试验时,可因沉淀剂(如PEG)的加入而发生假性混浊。

6 抗血清的鉴定

动物血采集后,立即分离出血清,此抗血清在保存或应用前,必须作效价和特异性鉴定。

6.1 双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性

按双向免疫扩散技术打两排孔,上排放抗原粗提物(如抗原来自动物血清则放相应的混合血清)和纯化抗原,下排加抗血清,进行双扩散18~24h后,仔细观察上下两排孔之间出现的沉淀线。若与粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线,且两者互相融合,则证明该动物已产生单价特异性抗体;不出现沉淀线,表明示免疫成功。若与纯化抗原出现一条,而与粗抗原出现多条线,且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接,也是成功的免疫,待取血后将杂抗体吸收去除,可以成为单价特异性抗体。

6.2 双向免疫扩散法则定抗血清效价

测定抗血清效价有两种稀释方法:一是稀释抗血清,如1/2、1/4、1/8、1/16对倍稀释,分别与一个浓度的纯抗原反应;另一是稀释抗原,即把抗原作对倍稀释或按浓度(如mg/ml)进行稀释,分别与不同浓度的抗血清进行双扩散试验(称为棋盘滴定),见表10-1。

表10-1抗血清效价测定

抗原 抗血清
不稀释 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128  
不稀释 +++ +++ +++ ++ ++
1/2 +++ +++ +++ ++ ++
1/4 +++ +++ +++ ++ ++
1/8 +++ ++ ++ ++
1/16 ++ ++ ++
1/32
1/64

表中+~+++代表出现沉淀线的浓度,如1:8抗体出现中等浓度沉淀线,与1:16、1:32则出现较弱的沉淀线。按表10-1的互为比例稀释后确定抗血清的效价为1:32,最佳抗原浓度为1:16。效价在1:8以上即可采用于一般试验。

6.3 其他鉴定方法

有时,因抗原特殊,沉淀线不易出现,特别是制备的抗血清将用于某种试验时,则考虑用其它方法(如血凝试验、抑制试验、中和试验、放射免疫技术等)测定其效价。

7 抗血清的保存

抗血清保存有三种方法。第一种是4℃保存,将抗血清清除菌后,液体状态保存于普通冰箱,可以存放3个月到半年,效价高时,一年之内不会影响使用。保存时要加入0.1%~0.2%NaN3防腐。如若加入半量的甘油保存期可延长。第二种方法是低温保存,放在-20~-40,一般保存5年效价不会有明显下降,但应防止反复冻融,反复冻融几次则效价明显降低。因此低温保存应用小包装,以备取出后在短期内用完。第三种方法是冰冻干燥,最后制品内水分不应高于0.2%,封装后可以长期保存,一般在冰箱中5~10年内效价不会明显降低。

8 抗血清中抗体的纯化

单价特异性是指血清只与其特异性抗原发生反应。有时免疫原不纯,含有微量的杂抗原(性质相近的),制得的抗血清中出现2~3种杂抗体。即使用纯抗原,例如用高度纯化的IgG免疫动物,出现的抗体总是有抗γ重链的抗体,也有抗κ轻链和抗λ轻链的抗体。还有一种情况,有些蛋白质和其他蛋白质处于一种结合状态,如甲胎蛋白常和白蛋白相结合,因此免疫得到的抗血清总是有抗白蛋白杂抗体存在。

8.1 除去杂抗体有两种方法:

1.亲和层析法将交叉杂抗原交联到琼脂糖珠4B上,如除去抗白蛋白抗体,则交联上白蛋白或不含甲胎蛋白的血清,装柱后,将预吸收的抗体通过亲和层析柱,杂抗体吸附在柱上,流出液则是单价特异性抗体。

2.吸附剂方法用不含特异性抗原的抗原液,即不含用于免疫动物抗原的其他杂抗原液,如血清、组织液或已知的某种杂抗原,用双功能试剂将其交联,做成固相吸附剂。如用不含甲胎蛋白的血清,稀释1倍后,加入0.25%的戊二醛丙酮醛,放冰箱一夜后,该血清成为胶冻状,用力打碎(或用组织粉碎器),用缓冲液多次洗涤后,则成为颗粒状凝胶吸附剂。用这种吸附剂直接加到抗血清中(约1/10),抗原则与杂抗体结合,上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。有时因杂抗体太多,必须处理吸收两次才能完全去除。吸附过的凝胶,用3mol/L硫氰酸钾(或钠)洗涤,洗脱掉杂抗体,可再继续使用。

有时杂抗原较少,其他蛋白也少,加入戊二醛后不形成胶冻状,此时可加入无关蛋白进行交联,如牛血清蛋白兔血清、马血清、卵白蛋白等。加入量以达到含总蛋白的2%~3%为宜。

8.2 特异性IgG抗体的制备

在标记的免疫测定或其他技术中将特异性抗体纯化出来,是极为重要的。例如在ELISA,用于包被的抗体一定要用特异性IgG,才能得到良好的效果。这是因为全血清中有大量非抗体蛋白,如白蛋白、α1和α2球蛋白等,如不除去,会干扰包被。再如反相间接血凝,致敏红细胞的抗体也需用特异性IgG的I(ab')2才能使实验满意。特异性IgG和F(ab')2的制备方法有如下几种。

(一)粗提法提取球蛋白

大多用硫酸盐析法硫酸钠盐析法。硫酸铵盐析须经过多次沉淀,第一次用40%饱和度,第二次用35%饱和度,第三次用33%饱和度,经三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸钠法更简便,用20%即可将γ球蛋白沉淀出来。经盐析后的γ球蛋白虽大多属于IgG,但还有5%其他区带蛋白,如γ区的杂蛋白。又因IgG组分中还含其他所谓正常的IgG,产生干扰。因此盐析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的实验,或者是抗体效价较高的抗血清。

(二)离子交换层析法提取IgG

常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素,以QAE-Sephadex最为理想,DE22、32、52也可应用。取QAE-SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5~8.6的磷酸盐缓冲液中平衡,将水分抽干,称湿重Ig加于10ml血清中,在室温30min后,离心过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次,即获得较纯的IgG,甚至不含其他杂蛋白。用该技术纯化IgG简便,不损坏抗体,既可小量提取,也可大量制备。

(三)亲和层析法提取特异性IgG

将纯化抗原或粗制抗原(如是单价特异性则对抗原要求不高)交联Sepharose4B制成亲和层析柱,将抗血清过柱后洗去未结合的杂蛋白,再用硫氰酸钾洗脱,流出的是纯的特异性IgG抗体。因硫氰酸钾对抗体有破坏作用,应及时透析除去。纯化的IgG因含量低,失去保护作用,应及时应用或冻干保存,亦可20℃保存,但皆不理想;加入三乙醇胺或甘油可起保护作用。

(四)酶解法制备F(ab')2片段

胃蛋白酶对IgG的作用点是在连接两重链的二硫键靠C端处(232氨基酸处),结果两个Fab由二硫键连接,保留了抗体的结合点。与IgG相比,F(ab')2的特点是去掉了Fc段,这样在细胞免疫实验中免除了受体作用;同时也使IgG失去主要的抗原特性,不被抗IgG抗体结合;在反向间接血凝中,用F(ab')2致敏羊红细胞比用IgG效果好。

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