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青霉素酶及其活力测定法

1 拼音

qīng méi sù méi jí qí huó lì cè dìng fǎ

  培养基 胨 15g 甘油 50g 氯化钠 4g 0.1%硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液 0.5ml 枸橼酸钠 5.88g 20%硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液 1ml 磷酸氢二钾 4g 肉浸液 1000ml

混合上述成分,调节pH值使灭菌后为7.0~7.2,分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。

2 酶溶液的制备

蜡样芽孢杆菌[Bacillus

cereus

CMCC(B)63301]的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后,取此培养物接种至其余各瓶培养基内,每瓶接种10ml,同时每瓶加入无菌青霉素4500单位,在25℃摇床培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体,调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌,滤液用无菌操作调pH值至近中性后,分装于适宜容器内,在10℃以下贮存,备用。

3 酶活力测定法

青霉素溶液

称取青霉素钠(钾)适量,用磷酸缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。

青霉素酶稀释液

取青霉素酶溶液,按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000~12 000单位的溶液,在37℃预热。

测定法

精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中,预热至37℃后,精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml,迅速混匀,在37℃准确放置1小时,精密量取3ml,立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)[精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml,置100ml量瓶中,用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定,至近终点时,加淀粉指示液,继续滴定至蓝色消失。

空白试验

取已预热的青霉素溶液2ml,在37℃放置1小时,精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml,然后精密加青霉素酶稀释液1ml,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算:

E=(B-A)×M×F×D×100

式中

E为青霉素酶活力,(单位/ml)/小时;

B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;

A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;

M为硫代硫酸钠滴定液的浓度,mol/L;

F为在相同条件下,每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数;

D为青霉素酶溶液的稀释倍数。

[附注]

磷酸盐缓冲液(pH7.0)

取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。

醋酸钠缓冲液(pH4.5)

冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml,两液混合均匀。

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