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载脂蛋白AⅠ

1 拼音

zǎi zhī dàn bái AⅠ

2 英文参考

apolipoprotein A-I

APOA-Ⅰ

3 概述

载脂蛋白是血浆脂蛋白部分各类脂蛋中均含有一种和几种不同特异性载脂蛋白。目前已经发现的载脂蛋白有20余种。其中主要有aPOA1、A、B-100、B48、C、C、C、D、E等。

4 载脂蛋白AⅠ医学检查

4.1 检查名称

载脂蛋白AⅠ

4.2 载脂蛋白AⅠ的别名

APOA-Ⅰ

4.3 分类

血液生化检查 > 脂类测定

4.4 原理

(1)免疫透射比浊法血清apoAⅠ与试剂中的特异性抗人apoAⅠ抗体相结合,形成不溶性免疫复合物,使反应液产生混浊,以光度计在波长340nm测出吸光度,代表混浊程度,浊度高低反映血清标本中apoAⅠ的含量,后者可由校准血清所作校准曲线读出。

试剂中聚乙二醇PEG)有促进抗原抗体反应作用。apoAⅠ主要存在于HDL颗粒表面,血清稀释及表面活性剂有助于HDL apoAⅠ抗原位点暴露,使之能充分地与特异性抗体起反应,表面活性剂还可减轻血清空白浊度。

(2)火箭电泳法:火箭免疫电泳法是单向免疫扩散法的一种改进,通过应用直流电(稳压稳流)使抗原(apoAⅠ和B)在含有特异性抗体的琼脂凝胶中扩散,pH 8.6时抗原向阳极移动,在泳动途中与凝胶中的抗体反应,逐渐形成类似火箭的沉淀峰。其峰高(或峰面积)与抗原浓度成正比,故可作抗原定量。

4.5 试剂

(1)免疫透射比浊法:

样品稀释剂:pH 7.4的磷酸缓冲液(0.01mol/L磷酸盐中含0.15mol/L氯化钠),内含PEG-6000 40g/L及表面活性剂适量(选用聚氧乙烯月桂醚类,如Thesit或Tween-20),用GS玻芯漏斗抽滤后用。本试剂的吸光度A340nm<0.05,在2~6℃冰箱中可存放半年。如半年后A值仍<0.05,可继续应用,如>0.05可按上述条件抽滤后再用。

②羊或兔抗人apoAⅠ抗血清:原血清效价以1∶32~1∶64为宜。抗血清可用含PEG-6000的磷酸盐缓冲液(不含表面活性剂)或用硫酸铵沉淀法纯化。抗血清应用液浓度因各批抗血清的效价及免疫亲和力而异(应按试剂盒说明书,临用前稀释)。抗血清中含防腐剂,在2~6℃冰箱中可存放半年。原血清(冻干)在低温冰箱中(-20℃以下)可贮存数年。

③参考血清:现在已有国际标准,即WHO apoAⅠ参考物质SPI-01(冻干血清)。符合国际标准的校准血清由卫生部北京老年医学研究所提供。

校准血清保存在-20℃以下,至少稳定半年,化冻后必须彻底混匀后才能应用。最好备有高、中、低浓度(例如apoAⅠ 2.0,1.3与0.6g/L左右)的校准血清各1份。便于作校准曲线。

(2)火箭电泳法:

①巴比妥缓冲液,离子强度0.05,pH8.6。

②10g/L琼脂糖(标准电内渗)用巴比妥缓冲液配制,加热溶化,混合后,分装10ml/管,冷后4℃贮存。

③0.15mol/L NaCl溶液

④兔(或羊)抗人apoAⅠ抗血清(效价不低于1∶16)及apoB抗血清(效价不低于1∶32)。

⑤校准血清(同比浊法)。

⑥染色液:考马斯亮蓝R-250 0.25g溶于甲醇45ml中,加入冰醋酸10ml及水45ml,混合,溶后备用。

脱色液:每升含冰醋酸50ml及甘油100ml。

4.6 操作方法

4.6.1 免疫透射比浊法

①标本应是及时分离的空腹血清,可密封存放在2~6℃冰箱中,1周内测定,-20℃可存放半年。

②用全自动分析仪时,应根据不同仪器设计参数,合理选择抗原抗体比例及反应时间。也可作速率法散射比浊测定apoAⅠ如用Beckman比浊仪ICS或protein array system)。

③手工法所用仪器:精密光度计,具有340nm滤光片(或分光器),样品池体积以0.5ml为宜(为节省抗血清),最好用流动杯,样品稀释最好用稀释器、经校正的加样器。

④标本处理:将血清标本及质控血清各用样品稀释剂作1∶200稀释,即先作1∶20稀释(5.Oμl血清+95μl稀释剂)后,再作1∶10稀释(多余的1∶20血清作测定apoB用)。然后按表1操作。

质控同上处理。

混匀后,25~37℃放置30min,在波长340nm比浊,根据U-UB的A值,在标准曲线上读出结果。

本法批间CV<5%。

⑤校准曲线:在手工与半自动操作中每批测定均需作校准曲线,可将校准血清稀释成1∶100、1∶200、1∶300和1∶400等4种浓度,与标本同样操作,根据定值计算出每个标准管apoAⅠ浓度,以浓度(X)与其相应的A值(Y)作图(用直线回归计算),基本上成直线,但在Y轴上有一定截距,所以不能用单点标准。操作准确时浓度与A值的相关系数应在0.985以上。

如有高、中、低浓度的三份校准血清时,可与标本同样操作,做三点定标,也可作五点定标(即高、中浓度的血清等量混合,及中、低浓度的血清等量混合,成为另两份校准血清)。

本法线性范围:0.4~2.5g/L。

附注:

①关于抗血清:比浊测定与其他方法相比对抗血清的要求更高。比浊法以用多克隆抗体为宜。抗血清中必须不含杂抗体。必须十分重视从人血清中提取的apoAⅠ达到免疫纯、色谱纯与电泳纯,这不是一般实验室都能做到的。抗血清效价(滴度)不可低于16。目前国内某些商品试剂中,apoAⅠ抗血清效价极低,选购试剂盒时必须注意。如果没有在选购前鉴定抗血清质量的经验,应请有条件的单位鉴定之。

②上法中标本(血清)稀释200倍是为了便于手工操作(加样100μl),如有精密加样器,可作20倍稀释(用10μl)。为了适合不同实验室的条件(如不同类型的自动化仪器),作适当修改时应注意抗原抗体的比例,必须十分注意反应体系中不可有抗原过量,线性上限不可低于2.5g/L。换言之,抗血清用量必须充裕,否则标本中apoAⅠ高水平时测出结果偏低。目前国内某些商品试剂盒不但抗血清效价过低,操作中所定标本用量又过大(如3~5μl),抗体明显不足,测出结果必然不准确。

③为了达到准确测定的目的,apoAⅠ与B比浊测定(终点法)中必须作校准曲线计算结果。一定范围(低标本用量)浓度(X)与浊度(Y)基本上成直线关系,直线回归计算出在Y轴上有一定截距(A值<0.1),所以用单点校准计算结果偏差较大,使测出结果不能准确反映浓度的高低(高的偏低,低的偏高)。千万不要因为单点法简便而忽略了测定的准确性。无论用何种自动化仪器,必须先试作校准曲线。如果在所用仪器及特定条件下反复测试,回归线的截距不明显时,才能采用单点校准法。标本用量在3~5μl时,即使加大抗血清用量,浓度与浊度也不成直线关系,只能用曲线直线化转换后计算。

④主要干扰因素是血清本身的混浊(如高脂血清),用超离心脂肪酶水解等标本预处理方法都不实用。用表面活性剂消浊的作用也有限,所以在测定中必须作标本空白管。除了自动分析中可采用两点法外,手工法用单一试剂而不扣除标本空白的做法是错误的。为了减少基质效应对浊度反应的影响,必须用定值血清作校准物。此外,尘埃粒子、比浊皿划痕等干扰也必须排除。

⑤有的商品试剂盒(包括某些进口产品)所附校准血清定值不准确,是误差的重要来源。

4.6.2 火箭电泳法

①浇板:每板用10g/L琼脂糖10ml,沸水浴中融化,混匀,冷至50~55℃时加入apoAⅠ抗血清50μl,apoB抗血清8μl(用量视抗血清效价而定),迅速混匀后倒在预置在水平台上的玻璃板上,冷后放在4℃,20min后打孔,孔在板的阴极端,孔径3mm,孔间距至少5mm,孔容量5μl。把板放入电泳槽,用滤纸搭桥

②稀释抗原:用0.15mol/L NaCl液将校准血清稀释成1∶100,1∶150,1∶200,1∶300,及1∶400(作校准曲线之用),血清标本按1∶200稀释,放4℃冰箱不得超过3天。

③加样:在低电流状态(10mA/板)将稀释好的定值血清及标本分别吸取5μl(准确),加入琼脂糖凝胶加样孔内。每板都要做一系列标准。

④通电:稳流24mA/板,端电压6~8V/cm,以流水冷却使琼脂糖保持15℃,电泳3~4h。

⑤脱杂蛋白及制干胶膜:电泳后的琼脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min,将胶膜托置于聚酯薄膜上,用多层滤纸在轻轻加压下吸干胶内水分,然后将滤纸、胶膜与聚酯膜三者一起自然干燥,或用热吹风器吹干,干后胶膜会自然与滤纸及聚酯膜分开。

⑥染色:将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20~30min。

⑦脱色:用脱色液浸泡已染色的胶膜至火箭峰清晰,背景基本无色。可在水中用两片玻璃纸将胶膜夹住,晾干后可长期保存。也可以用流水浸泡脱色至背景干净。

附注:

①抗原稀释倍数与抗血清用量的选择,应以火箭峰清晰、校准曲线斜率适中并成直线为宜。本法同时测定apoAⅠ与apoB,应调整两种抗血清用量,使二者峰高有区别,apoB峰高不小于1cm。

②不同种类来源的抗血清(如兔与羊),在等效价的情况下进行试验,结果会有差异。apoAⅠ测定以兔抗血清为好。用兔血清时峰形尖细,而羊血清所产生的峰粗,峰尖圆钝,有时在峰顶前出现虚影。校准血清所作校准曲线斜率也不同。但不论用何种抗血清,定量结果差别不大。

③在一定条件下电泳,不同稀释度校准血清的峰高不会有明显变动,校准曲线斜率基本一致。如标本峰高超出校准曲线范围时,应调整标本稀释倍数后重测。板间CV通常小于5%。

④火箭电泳结果可以用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰。前者用标本少,节省抗血清,但如适当增加标本及抗血清用量,不染色更为方便。所用琼脂糖应为标准电渗或低电渗的,凝胶中加入适量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。

⑤火箭峰的测量可以计算面积或峰高,面积是峰高乘以峰宽(峰半高处的宽度)。测量精度最好能达0.1mm。须用机械或电子放大设备。标准曲线范围内峰高以1~4cm为宜。

⑥本法适用于少量标本分析。也适用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)测定。

4.7 正常值

免疫透射比浊法:1.01~1.32g/L;

火箭免疫电泳法:1.02~1.36g/L。

4.8 临床意义

降低:冠心病糖尿病肾病综合征遗传性ApoA-Ⅰ缺乏症(Tangier病)、家族性低α-脂蛋白血症、鱼眼病、重度营养不良、肝炎活动期、肝功能低下。

4.9 附注

4.9.1 (1)免疫透射比浊法:

①关于抗血清:比浊测定与其他方法相比对抗血清的要求更高。比浊法以用多克隆抗体为宜。抗血清中必须不含杂抗体。必须十分重视从人血清中提取的apoAⅠ达到免疫纯、色谱纯与电泳纯,这不是一般实验室都能做到的。抗血清效价(滴度)不可低于16。目前国内某些商品试剂中,apoAⅠ抗血清效价极低,选购试剂盒时必须注意。如果没有在选购前鉴定抗血清质量的经验,应请有条件的单位鉴定之。

②上法中标本(血清)稀释200倍是为了便于手工操作(加样100μl),如有精密加样器,可作20倍稀释(用10μl)。为了适合不同实验室的条件(如不同类型的自动化仪器),作适当修改时应注意抗原抗体的比例,必须十分注意反应体系中不可有抗原过量,线性上限不可低于2.5g/L。换言之,抗血清用量必须充裕,否则标本中apoAⅠ高水平时测出结果偏低。目前国内某些商品试剂盒不但抗血清效价过低,操作中所定标本用量又过大(如3~5μl),抗体明显不足,测出结果必然不准确。

③为了达到准确测定的目的,apoAⅠ与B比浊测定(终点法)中必须作校准曲线计算结果。一定范围(低标本用量)浓度(X)与浊度(Y)基本上成直线关系,直线回归计算出在Y轴上有一定截距(A值<0.1),所以用单点校准计算结果偏差较大,使测出结果不能准确反映浓度的高低(高的偏低,低的偏高)。千万不要因为单点法简便而忽略了测定的准确性。无论用何种自动化仪器,必须先试作校准曲线。如果在所用仪器及特定条件下反复测试,回归线的截距不明显时,才能采用单点校准法。标本用量在3~5μl时,即使加大抗血清用量,浓度与浊度也不成直线关系,只能用曲线直线化转换后计算。

④主要干扰因素是血清本身的混浊(如高脂血清),用超离心或脂肪酶水解等标本预处理方法都不实用。用表面活性剂消浊的作用也有限,所以在测定中必须作标本空白管。除了自动分析中可采用两点法外,手工法用单一试剂而不扣除标本空白的做法是错误的。为了减少基质效应对浊度反应的影响,必须用定值血清作校准物。此外,尘埃粒子、比浊皿划痕等干扰也必须排除。

⑤有的商品试剂盒(包括某些进口产品)所附校准血清定值不准确,是误差的重要来源。

4.9.2 (2)火箭电泳法:

①抗原稀释倍数与抗血清用量的选择,应以火箭峰清晰、校准曲线斜率适中并成直线为宜。本法同时测定apoAⅠ与apoB,应调整两种抗血清用量,使二者峰高有区别,apoB峰高不小于1cm。

②不同种类来源的抗血清(如兔与羊),在等效价的情况下进行试验,结果会有差异。apoAⅠ测定以兔抗血清为好。用兔血清时峰形尖细,而羊血清所产生的峰粗,峰尖圆钝,有时在峰顶前出现虚影。校准血清所作校准曲线斜率也不同。但不论用何种抗血清,定量结果差别不大。

③在一定条件下电泳,不同稀释度校准血清的峰高不会有明显变动,校准曲线斜率基本一致。如标本峰高超出校准曲线范围时,应调整标本稀释倍数后重测。板间CV通常小于5%。

④火箭电泳结果可以用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰。前者用标本少,节省抗血清,但如适当增加标本及抗血清用量,不染色更为方便。所用琼脂糖应为标准电渗或低电渗的,凝胶中加入适量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。

⑤火箭峰的测量可以计算面积或峰高,面积是峰高乘以峰宽(峰半高处的宽度)。测量精度最好能达0.1mm。须用机械或电子放大设备。标准曲线范围内峰高以1~4cm为宜。

⑥本法适用于少量标本分析。也适用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)测定。

4.10 相关疾病

冠心病     肾病综合征     糖尿病

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