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2010年版药典二部附录Ⅺ

目录

1 拼音

2010nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅺ

中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录Ⅺ

2 附录Ⅺ A 抗生素微生物检定法

本法系在适宜条件下,根据量反应平行线原理设计,通过检测抗生素微生物抑制作用,计算抗生素活性(效价)的方法

抗生素微生物检定包括两种方法,即管碟法和浊度法。测定结果经计算所得的效价,如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时,应调整其估计效价,重新试验。除另有规定外,本法的可信限率不得大于5%。

2.1 第一法 管碟法

本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用,比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小,以测定供试品效价的一种方法。

2.1.1 菌悬液的制备

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)悬液  取枯草芽孢杆菌(CMCC(B) 63 501]的营养琼脂斜面培养物,接种子盛有营养琼脂培养基的培养瓶中,在35~37℃培养7日,用革兰染色法涂片镜检,应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下,在65℃加热30分钟,备用。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液  取短小芽孢杆菌(CMCC(B) 63 202]的营养琼脂斜面培养物,照上述方法制备。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液  取金黄色葡萄球菌(CMCC(B) 26 003]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在35~37℃培养20~22小时。临用时,用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下,备用。

藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液  取藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]的营养琼脂斜面培养物,接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中,在26~27℃培养24小时,或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下,备用。

大肠埃希菌(Escherichia coli)悬液  取大肠埃希菌[CM-CC(B) 44 103]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在35~37℃培养20~22小时。临用时,用灭菌水将菌苔洗下,备用。

啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)悬液  取啤酒酵母菌[ATCC 9763]的V号培养基琼脂斜面培养物,接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32~35℃培养24小时,用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中,振摇均匀,备用。肺炎克雷伯菌(Klebosiella Pneumoniae)悬液  取肺炎克雷伯菌[CMCC(B) 46 117]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在35~37℃培养20~22小时。临用时,用无菌水将菌苔洗下,备用。

支气管博德特菌(Bordetella Bronchiseptica)悬液  取支气管炎博德特菌[CMCC(B) 58 403]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在32~35℃培养24小时。临用时,用无菌水将菌苔洗下,备用。

2.1.2 标准品溶液的制备

标准品的使用和保存,应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。

标准品的品种分子式及理论计算值见表2。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称(或量)取供试品适量,用各品种项下规定的溶剂溶解后,再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。

表1  抗生素微生物检定试验设计表

抗生素类别

试验菌

培养基

灭菌缓冲液

抗生紊浓度范围

培养条件

编号

pH值

pH值

单位/ml

温度/℃

时间/小时

链霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

7.8~8.0

7.8

0.6~1.6

35~37

14~16

卡那霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

7.8~8.0

7.8

0.9~4.5

35~37

14~16

阿米卡星

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

7.8~8.0

7.8

0.9~4.5

35~37

14~16

巴龙霉索

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

7.8~8.0

7.8

0.9~4.5

35~37

14~16

核糖霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

7.8~8.0

7.8

2.0~12.0

35~37

14~16

卷曲霉索

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

7.8~8.0

7.8

10.0~40.0

35~37

14~16

磺苄西林

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

I

6.5~6.6

6.O

5.0~10.0

35~37

14~16

续表

抗生素类别

试验菌

培养基

灭菌缓冲液

抗生素浓度范围

培养条件

编号

pH值

pH值

单位/ml

温度/℃

时间/小时

去甲万古霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

6.0

6.0

9.0~43.7

35~37

14~16

庆大霉素

短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63 202]

7.8~ 8.0

7.8

2.0~12.0

35~37

14~16

红霉素

短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63 202]

7.8~8.0

7.8

5.0~20.0

35~37

14~16

新霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.8~8.0

7.8③

4.0~25.0

35~37

14~16

四环素

藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]

6.5~6.6

6.0

10.0~40.0

35~37

14~16

土霉素

藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]

6.5~6.6

6.0

10.0~40.0

35~37

16~18

金霉素

藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]

6.5~6.6

6.0

4.0~25.0

35~37

16~18

氯霉素

藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]

6.5~6.6

6.0

30.0~80.03

35~37

16~18

杆菌肽

藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]

6.5~6.6

6.0

2.0~12.0

35~37

16~18

黏菌素

大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]

7.2~7.4

6.0

614~2344

35~37

16~18

两性霉素B

啤酒酵母菌(ATCC 9763)

6.0~6.2

10.5

0.5~2.0

35~37

24~36

奈替米星

短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63 202]

7.8~8.0

7.8

5~20

35~37

14~16

西索米星

短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63 202]

7.8~8.0

7.8

5~20

35~37

14~16

阿奇霉素

短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63 202]

7.8~8.0

7.8

0.5~20

35~37

16~18

磷霉素

藤黄微球菌[CMCC(B) 28 001]

7.8~8.0

7.8

5~20

35~37

18~24

乙酰螺旋霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

8.0~8.2

7.8

5~403

35~37

14~16

妥布霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

7.8~8.0

7.8

1~4

35~37

14~16

罗红霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

7.8~8.0

7.8

5~10

35~37

16~18

克拉霉素

短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63 202]

7.8~ 8.0

7.8

2.0~8.0

35~37

14~16

大观霉素

肺炎克雷伯菌[CMCC(B) 46 117]

7.8~8.0

7.0

50~200

35~37

16~18

吉他霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

8.0~8.2

7.8

20~40

35~37

16~18

麦白霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

营养琼脂培养基

8.0~8.2

7.8

5~40

35~37

16~18

小诺霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

7.8~ 8.0

7.8

0.5~2.0

35~37

14~16

多黏菌素B

大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]

营养琼脂培养基

6.5- 6.6

6.0

1000~4000

35~37

16~18

交沙霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

7.8~8.0

7.8

7.5~30

35~37

14~16

丙酸交沙霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

7.8~ 8.0

7.8

20~80

36~37

14~16

替考拉宁

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

6.5~6.6

6.0

20~40

36~37

14~16

万古霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]

6.0

6.0

2.5~12.5

35~37

14~16

①两性霉素B双碟的制备,用菌层15ml代替两层。

②乙酰螺旋霉素,抗Ⅱ检定培养基制备时,调节pH值使灭菌后为8.0~8.2。

③含3%氯化钠。

④加0.3%葡萄糖

表2 抗生素标准品品种与理论值

标准品品种

标准品分子式或品名

理论计算值u/mg

链霉素

(C21H39N7O122·3H2SO4

798. 3

卡那霉素

C18H36N4O11·H2SO4

831.6

阿米卡星

C22H43N5O13·nH2SO4(n=1.8或2)

核糖霉素

C17H34N4O10·nH2SO4 (n<2)

新霉素

硫酸新霉素

庆大霉素

硫酸庆大霉素

磺苄西林

C16H16N2Na2O7S

904.0

四环素

C22H24N2O8·HCl

1000

土霉素

C22H24N2O9·2H2O

927

西索米星

(C19H37N5O72·5H2SO4

646.3

磷霉素

C3H5CaO4P·H2O

711.5

乙酰螺旋霉素

乙酰螺旋霉素

克拉霉素

C38H69NO13

1000

大观霉素

C14H24N2O7·2HCl·5H2O

670.9

小诺霉素

C20H41N5O7·5/2H2SO4

654.3

多黏菌素B

硫酸多黏菌素B

金霉素

C22H23ClN2O8·HCl

1000

标准品品种

标准品分子式或品名

理论计算值u/mg

红霉素

C37H67NO13

1000

氯霉素

C11H12Cl2N2O5

1000

杆菌肽

杆菌肽锌

黏菌素

硫酸黏菌素

去甲万古霉素

C65H73Cl2N9O24·HCl

975. 2

卷曲霉素

硫酸卷曲霉素

两性霉素B

C47H73NO17

1000

巴龙霉素

C23H45N5O14·nH2SO4

奈替米星

(C21H41N5O72·5H2SO4

660.1

阿奇霉素

C38H72N2O12

1000

妥布霉素

C18H37N5O9

1000

罗红霉素

C41H76N2O15

1000

吉他霉素

吉他霉素

麦白霉素

麦白霉素

交沙霉素

C42H69NO15

1000

丙酸交沙霉素

C45H73NO16

937

替考拉宁

C72~89H68~99Cl2N8~9O28~33

1000

2.1.4 双碟的制备

取直径约90mm,高16~17mm的平底双碟,分别注入加热融化的培养基(表1)20ml,使在碟底内均匀摊布,放置水平台面上使凝固,作为底层。另取培养基适量加热融化后,放冷至48~50℃(芽孢可至60℃),加入规定的试验菌悬液适量(能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18~22mm,三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15~18mm),摇匀,在每1双碟中分别加入5ml,使在底层上均匀摊布,作为菌层。放置在水平台上冷却后,在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管(内径为6.0mm±0.1mm,高为10.0mm±0.1mm,外径为7.8mm±0.1mm)4个(二剂量法)或6个(三剂量法),用陶瓦圆盖覆盖备用。

2.1.5 检定法

二剂量法  取照上述方法制备的双碟不得少于4个,在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液,其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液;高、低浓度的剂距为2:1或4:1。在规定条件下培养后,测量各个抑菌圈直径(或面积),照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。三剂量法  取照上述方法制备的双碟不得少于6个,在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度(S3)、中浓度(S2)及低浓度(S1)的标准品溶液,其余3个小管中分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液;高、低浓度的剂距为1:0.8。在规定条件下培养后,测量各个抑菌圈直径(或面积),照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的(3.3)法进行可靠性测验及效价计算。

2.2 第二法  浊度法

本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用,通过测定培养后细菌浊度值的大小,比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度,以测定供试品效价的一种方法。

2.2.1 菌悬液制备

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液  取金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在35~37℃培养20~22小时。临用时,用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下,备用。

大肠埃希菌(Escherichia coli)悬液  取大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在35~37℃培养20~22小时。临用时,用灭菌水将菌苔洗下,备用。

白色念珠菌(Candida albicans)悬液  取白色念珠菌[CMCC(F)98 001]的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物,接种于10ml培养基Ⅸ中,置35~37℃培养8小时,再用培养基Ⅸ稀释至适宜浓度,备用。

2.2.2 标准品溶液的制备

标准品的使用和保存,应照标准品说明书的规定。临用时照表3的规定进行稀释。

标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称(或量)取供试品适量,照各品种项下规定进行供试品溶液的配制。

表3 抗生素微生物检定浊度法试验设计表

抗生素类别

试验菌

培养基

灭菌缓冲液

抗生素浓度范围

培养条件

编号

pH值

pH值

单位/ml

温度/℃

庆大霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

0.15~1.0

35~37

链霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

2.4~10.8

35~37

阿米卡星

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

7.8

0.8~2.0

35~37

红霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

7.8

0.1~ 0.85

35~37

新霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

0.92~1.50

35~37

四环素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

6.0

0.05~0.33

35~37

氯霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.0

5.5~13.3

35~37

奈替米星

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

0.1~ 2.5

35~37

西索米星

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

7.8

0.1~ 0.25

35~37

阿奇霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

1.0~ 5.0

35~37

磷霉素钠

大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]

7.0~7.2

7.0

12~42

35~37

磷霉素钙

大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]

7.0~7.2

7.0

12.0~ 31.0

35~37

磷霉素氨丁三醇

大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]

7.0~7.2

7.0

12.0~ 31.0

35~37

乙酰螺旋霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

7.8

5.0~16.0

35~37

妥布霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

7.8

0.3~1.1

35~37

大观霉素

大肠埃希菌[CMCC(B) 44 103]

7.0~7.2

7.0

30~72

35~37

吉他霉素

金黄色葡萄球菌[CMOC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

0.8~2.4

35~37

麦白霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

1.2~3.2

35~37

小诺霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

0.5~1.2

35~37

杆菌肽

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

6.0

0.06~0.30

35~37

交沙霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~ 7.2

5.6

1.0~4.0

35~37

丙酸交沙霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]

7.0~7.2

7.8

0.8~4.8

35~37

2.2.4 含试验菌液体培养基的制备

临用前,取规定的试验菌悬液适量(35~37℃培养3~4小时后测定的吸光度在0.3~0.7之间,且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1),加入到各规定的液体培养基中,混合,使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。

已接种试验菌的液体培养基应立即使用。

2.2.5 检定法

2.2.5.1 标准曲线法

除另有规定外,取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管,在各品种项下规定的剂量-反应线性范围内,以线性浓度范围的中间值作为中间浓度,标准品溶液选择5个剂量,剂量间的比例应适宜(通常为1:1.25或更小),供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量,每一剂量不少于3个试管。在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml,再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml,立即混匀,按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值(通常约为4小时),在线测定或取出立即加入甲醛溶液(1→3)0.5ml以终止微生物生长,在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml,再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml,其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照,另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml,混匀,作为吸光度测定的空白液。照标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。

抗生素微生物检定法标准曲线法的计算及统计学检验标准曲线法的计算及可靠性检验

1.标准曲线的计算

将标准品的各浓度1g值及相对应的吸光度列成表4。

表4 抗生素标准品浓度lg值与吸光度表

组数

抗生素浓度lg值

吸光度

1

2

3

4

n

x1

x2

x3

x4

xn

y1

y2

y3

y4

yn

平均值

x

y

按公式(1)和(2)分别计算标准曲线的直线回归系数(即斜率)b和截距a,从而得到相应标准曲线的直线回归方程(3):

回归系数:

截距:    a=-b    (2)

直线回归方程:    Y=bX+a    (3)

2.回归系数的显著性测验

判断回归得到的方程是否成立,即X、Y是否存在着回归关系,可采用t检验。

假设H0:b=0,在假设H0成立的条件下,按公式(4)~(6)计算t值。

估计标准差

回归系数标准误:

式中yi为标准品的实际吸光度;

Y为估计吸光度[由标准曲线的直线回归方程(3)计算得到];

为标准品实际吸光度的均值;

xi为抗生素标准品实际浓度lg值;

为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。

对于相应自由度(2n-4)给定的显著性水平a(通常a=0.05),查表得ta/2(n-2),若|t|>ta/2(n-2),则拒绝H0,认为回归效果显著,即X、Y具有直线回归关系;若|t|≤ta/2(n-2),则接受H0,认为回归效果不显著,即X、Y不具有直线回归关系。

3.测定结果的计算及可信限率估计

3.1抗生素浓度lg值的计算  当回归系数具有显著意义时,测得供试品吸光度的均值后,根据标准曲线的直线回归方程(3),按方程(7)计算抗生素的浓度lg值。

抗生素的浓度lg值:

3.2抗生素浓度(或数学转换值)可信限的计算按公式(4)和(8)计算得到的抗生素浓度lg值在95%置信水平(a=0.05)的可信限。

X0的可信限:

式中n为标准品的浓度数乘以平行测定数;

m为供试品的平行测定数;

X0为根据线性方程计算得到的抗生素的浓度lg值;

Y0为抗生素供试品吸光度的均值。

3.3可信限率的计算  按公式(9)计算得到的抗生素浓度(或数学转换值)的可信限率。

式中,X0应以浓度为单位。

其可信限率除另有规定外,应不大于5%。

3.4供试品含量的计算  将计算得到的抗生素浓度(将lg值转换为浓度)再乘以供试品的稀释度,即得供试品中抗生素的量。

2.2.5.2 二剂量法或三剂量法

除另有规定外,取大小一致的已灭菌的试管,在各品种项下规定的剂量反应线性范围内,选择适宜的高、(中、)低浓度,分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml,二剂量的剂距为2:1或4:1,三剂量的剂距为1: 0.8。同标准曲线法操作,每一浓度组不少于4个试管,按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的(2.2)法和(3.3)法进行可靠性测验及效价计算。

2.3 培养基及其制备方法

2.3.1 培养基Ⅰ

胨5g、琼脂15~20g、牛肉浸出粉3g、水1000ml、磷酸氢二钾3g

除琼脂外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,调节pH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6,在115℃灭菌30分钟。

2.3.2 培养基Ⅱ

胨6g、葡萄糖1g、牛肉浸出粉1~5g、琼脂15~20g、酵母浸出粉6g、水1000ml除琼脂和葡萄糖外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6,在115℃灭菌30分钟。

2.3.3 培养基Ⅲ

胨5g、磷酸氢二钾3.68g、牛肉浸出粉1.5g、磷酸二氢钾1.32g、酵母浸出粉3g、葡萄糖1g、氯化钠3.5g、水1000ml除葡萄糖外,混合上述成分,加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.0~7.2,在115℃灭菌30分钟。

2.3.4 培养基Ⅳ

胨10g、葡萄糖10g、氯化钠10g、琼脂20~30g、枸橼酸钠10g、水1000ml除琼脂和葡萄糖外,混合上述成允,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,在109℃加热15分钟,于70℃以上保温静置1小时后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为6.0~6.2,在115℃灭菌30分钟。

2.3.5 培养基V

胨10g、琼脂15~20g[1]麦芽糖40g、水1000ml除琼脂和麦芽糖外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,加麦芽糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为6.0~6.2,在115℃灭菌30分钟。

2.3.6 培养基Ⅵ

胨8g、酵母浸出粉5g、牛肉浸出粉3g、磷酸二氢钾1g、氯化钠45g、琼脂15~20g、

磷酸氢二钾3.3g、水1000ml、葡萄糖2.5g

除琼脂和葡萄糖外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.2~7.4,在115℃灭菌30分钟。

2.3.7 培养基Ⅶ

胨5g、枸橼酸钠10g、牛肉浸出粉3g、琼脂15~20g、磷酸氢二钾7g、水1000ml、磷酸二氢钾3g

除琼脂外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,调节pH值使灭菌后为6.5~6.6,在115℃灭菌30分钟。

2.3.8 培养基Ⅷ

酵母浸出粉1g、琼脂15~20g硫酸铵1g、磷酸盐缓冲液 (pH6.0)1000ml、

葡萄糖5g   混合上述成分,加热溶化后滤过,调节pH值使灭菌后为6.5~6.6,在115℃灭菌30分钟。

2.3.9 培养基Ⅸ

蛋白胨7.5g、氯化钠5.0g、酵母膏2.0g、葡萄糖10.0g、牛肉浸出粉1.0g、水1000ml除葡萄糖外,混合上述成分,加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为6.5,在115℃灭菌30分钟。

2.3.10 营养肉汤培养基

胨10g、肉浸液①1000ml、氯化钠5g

取胨和氯化钠加入肉浸液内,微温溶解后,调节pH值为弱碱性,煮沸,滤清,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,在115℃灭菌30分钟。

2.3.11 营养琼脂培养基

胨10g、琼脂15~20g、氯化钠5g、肉浸液①1000ml

除琼脂外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,调节pH值使灭菌后为7.0~7.2,分装,在115℃灭菌30分钟,趁热斜放使凝固成斜面。

注①肉浸液也可用牛肉浸出粉3g,加水1000ml,配成溶液代替。

2.3.12 改良马丁培养基

胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、硫酸镁0.5g、琼脂15~20g、磷酸氢二钾1.0g、水1000ml、葡萄糖20.0g

除葡萄糖外,混合上述成分,微温溶解,调节pH值约为6.8,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装,在115℃灭菌30分钟,趁热斜放使凝固成斜面。

2.3.13 多黏菌素B用培养基

蛋白胨6.0g、酵母浸膏3.0g、牛肉浸膏1.5g、琼脂15~20g、胰消化酪素4.0g、水1000ml、葡萄糖1.0g

除琼脂外,混合上述成分,调节pH值使比最终的pH值略高0.2~0.4,加入琼脂,加热溶化后滤过,调节pH值使灭菌后为6.5~6.7,在115℃灭菌30分钟。

培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替,临用时,照使用说明配制和灭菌,备用。

2.3.14 灭菌缓冲液

磷酸盐缓冲液(pH5.6)  取磷酸二氢钾9.07g,加水使成1000ml,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6,滤过,在115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液(pH6.0)  取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g,加水使成1000ml,滤过,在115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液(pH7.0)  取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g,加水使成1000ml,滤过,在115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液(pH7.8)  取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,加水使成1000ml,滤过,在115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液(pH10.5)  取磷酸氢二钾35g,加10mol/L氢氧化钠溶液2ml,加水使成1000ml,滤过,在115℃灭菌30分钟。

3 附录Ⅺ B 青霉素酶及其活力测定法

3.1 培养基

胨15g、0.1%硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml、氯化钠49 、枸橼酸钠5.889、20%硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml、磷酸氢二钾4g、甘油50g、肉浸液1000ml

混合上述成分,调节pH值使灭菌后为7.0~7.2,分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。

3.2 青霉素酶溶液的制备

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) (CMCC(B)  63 301]的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后,取此培养物接种至其余各瓶培养基内,每瓶接种10ml,同时每瓶加入无菌青霉素4500单位,在25℃摇床培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体,调节pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌,滤液用无菌操作调pH值至近中性后,分装于适宜容器内,在10℃以下贮存,备用。

3.3 酶活力测定

青霉素溶液的制备  称取青霉素钠(钾)适量,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。

青霉素酶稀释液的制备  取青霉素酶溶液,按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释成每1ml中约含青霉素酶8000~12000单位的溶液,在37℃预热。

3.4 测定法

精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中,预热至37℃后,精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml,迅速混匀,在37℃准确放置1小时,精密量取3ml,立即加至已精密量取的碘滴定液(0.005mol/L)[精密量取碘滴定液(0.05mol/L)10ml,置100ml量瓶中,用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定,至近终点时,加淀粉指示液,继续滴定至蓝色消失。

3.5 空白试验

取已预热的青霉素溶液2ml,在37℃放置1小时,精密加入上述碘滴定液(0.005mol/L)25ml,然后精密加青霉素酶稀释液1ml,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算:

E=(B-A)×M×F×D×100式中  E为青霉素酶活力,单位/(ml·小时);B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;

A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;

M为硫代硫酸钠滴定液的浓度,mol/L;

F为在相同条件下,每1ml的上述碘滴定液(0.005mol/L)相当于青霉素的效价,单位;

D为青霉素酶溶液的稀释倍数。

3.6 【附注】

磷酸盐缓冲液(pH7.0)  取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。

醋酸钠缓冲液(pH4.5)  取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml,两液混合均匀。

4 附录Ⅺ C 异常毒性检查法

本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液,在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况,以判定供试品是否符合规定的一种方法。

供试用的小鼠应健康合格,体重17~20g,在试验前及试验的观察期内,均应按正常饲养条件饲养。做过本试验的小鼠不得重复使用。

4.1 供试品溶液的制备

除另有规定外,用氯化钠注射液按各品种项下规定的浓度制成供试品溶液。

4.2 检查

除另有规定外,取上述小鼠5只,按各品种项下规定的给药途径,每只小鼠分别给予供试品溶液0.5ml。给药途径分为以下几种。

4.3 静脉注射

将供试品溶液注入小鼠尾静脉,应在4~5秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射的品种可延长至30秒。

4.4 腹腔注射

将供试品溶液注入小鼠腹腔。

4.5 皮下注射

将供试品溶液注入小鼠腹部或背部两侧皮下。口服给药  将供试品溶液通过适宜的导管,灌入小鼠胃中。结果判断  除另有规定外,全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡;如有死亡时,应另取体重18~19g的小鼠10只复试,全部小鼠在48小时内不得有死亡。

5 附录Ⅺ D 热原检查法

本法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

5.1 供试用家兔

供试用的家兔应健康合格,体重1.7kg以上,雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养,在此期间内,体重应不减轻,精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未曾用于热原检查的家兔;或供试品判定为符合规定,但组内升温达0.6℃的家兔;或3周内未曾使用的家兔,均应在检查供试品前3~7日内预测体温,进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同,仅不注射药液,每隔30分钟测量体温1次,共测8次,8次体温均在38.0~39.6℃的范围内,且最高与最低体温相差不超过0.4℃的家兔,方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔,如供试品判定为符合规定,至少应休息48小时方可再供热原检查用,其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上。如供试品判定为不符合规定,则组内全部家兔不再使用。

5.2 试验前的准备

在做热原检查前1~2日,供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃,且应控制在17~25℃,在试验全部过程中,实验室温度变化不得大于3℃,应防止动物骚动并避免噪声干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食,并置于宽松适宜的装置中,直至试验完毕。测量家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于1.5分钟,每隔30分钟测量体温1次,一般测量2次,两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔,正常体温应在38.0~39.6℃的范围内,且同组各兔间正常体温之差不得超过1℃。

与供试品接触的试验用器皿应无菌、无热原。去除热原通常采用干热灭菌法(250℃加热30分钟),也可用其他适宜的方法。

5.3 检查法

取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟以内,自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液,然后每隔30分钟按前法测量其体温1次,共测6次,以6次体温中最高的一次减去正常体温,即为该兔体温的升高温度(℃)。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或高于0.6℃,或3只家兔体温升高的总和达1.3℃或高于1.3℃,应另取5只家兔复试,检查方法同上。

5.4 结果判断

在初试的3只家兔中,体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只,并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃,均判定供试品的热原检查符合规定。

在初试的3只家兔中,体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只;或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃,均判定供试品的热原检查不符合规定。当家兔升温为负值时,均以0℃计。

6 附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。

本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示,1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml(用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水

试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法(250℃、30分钟以上)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

6.1 供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.2 内毒素限值的确定

药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定:

L=K/M

式中  L为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示;

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg·h)表示,注射剂K=5EU/(kg·h),放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h);

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示,人均体重按60kg计算,人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时,按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。

按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做必要调整,但需说明理由。

确定最大有效稀释倍数( MVD)  最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1→MVD),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:

MVD=cL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值;

c为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时,则c等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时,c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L;

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

6.2.1 方法1 凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

6.2.1.1 鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4管;另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃的恒温器中,保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25A管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。

λc=antilg(∑X/4)

式中  X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λc~2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

6.2.1.2 干扰试验

按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表1  凝胶法干扰试验溶液的制备

编号

内毒索浓度/被加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释

倍数

所含内毒

素的浓度

平行管数

A

无/供试品溶液

-

-

-

2

B

2λ/供试品溶液

供试品溶液

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

4

4

4

4

c

2λ/检查用水

检查用水

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

4

4

4

4

D

无/检查用水

-

-

-

2

注:A为供试品溶液;B为干扰试验系列;C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D为阴性对照。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。

Es=antilg(∑Xs/4)

Et=antilg(∑Xt/4)

式中  Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。

当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es~2Es(包括0.5Es和2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前,或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时,须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

6.2.1.3 检查法
6.2.1.3.1 (1)凝胶限度试验

按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表2 凝胶限度试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

平行管数

A

无/供试品溶液

2

B

2λ/供试品溶液

2

C

2λ/检查用水

2

D

无/检查用水

2

注:A为供试品溶液;B为供试品阳性对照;C为阳性对照;D为阴性对照。

结果判断  保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性,判定供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性,判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试。复试时,溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,判定供试品符合规定;否则判定供试品不符合规定。

6.2.1.3.2 (2)凝胶半定量试验

本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

结果判断  若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ~2λ之间,试验有效。

系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终点浓度,所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式CE=antilg(∑X/2)]。如果检验时采用的是供试品的稀释液,则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。

如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性,应记为内毒素浓度小于λ(如果检验的是稀释过的供试品,则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性,应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

若内毒素浓度小于规定的限值,判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值,判定供试品不符合规定。

表3 凝胶半定量试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释

倍数

所含内毒

素的浓度

平行

管数

A

无/供试品溶液

检查用水

1

2

4

8

-

-

-

-

2

2

2

2

B

2λ/供试品溶液

1

2

C

2λ/检查用水

检查用水

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

2

2

2

2

D

无/检查用水

-

-

-

2

注:A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍,最后的稀释倍数不得超过MVD。

B为2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。

C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

D为阴性对照。

6.2.2 方法2 光度测定法

光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或检测色度增长速度的方法。光度测定试验需在特定的仪器中进行,温度一般为37℃±1℃。

供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

6.2.2.1 标准曲线的可靠性试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。

用标准内毒素制成溶液,制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法,每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间,将全部数据进行线性回归分析

根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980,试验方为有效。否则须重新试验。

6.2.2.2 干扰试验

选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。

表4 光度测定法干扰试验溶液的制备

编号

内毒素浓度

被加入内毒素的溶液

平行管数

A

供试品溶液

至少2

B

标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm)

供试品溶液

至少2

c

至少3个浓度(最低一点设定为λ)

检查用水

每一浓度至少2

D

检查用水

至少2

注:A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。

B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的,且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。

C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

D为阴性对照。

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。

R=(cs-ct)/λm×100%

当内毒素的回收率在50%~200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

当内毒素的回收率不在指定的范围内,须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素,并重复干扰试验来验证处理的有效性。

当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

6.2.2.3 检查法

按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。

试验必须符合以下三个条件方为有效:

(1)系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求;

(2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后,计算出的内毒素的回收率要在50%~200%的范围内;

(3)溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

6.2.2.4 结果判断

若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后,小于规定的内毒素限值,判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值,判定供试品不符合规定。

注:本检查法中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。

7 附录Ⅺ F 升压物质检查法

本法系比较垂体后叶标准品(S)与供试品(T)升高大鼠血压的程度,以判定供试品中所含升压物质的限度是否符合规定。

7.1 标准品溶液的制备

同缩官素生物测定法标准品溶液的制备法(2010年版药典二部附录Ⅻ F),按垂体后叶标准品升压素单位计算,制成每1ml中含1单位的溶液,分装于适宜的容器内,4~8℃贮存,经验保持活性符合要求的条件下,可在3个月内使用。标准品稀释液的制备  临用前,精密量取标准品溶液适量,用氯化钠注射液制成每1ml中含0.1单位的溶液。

7.2 供试品溶液的制备

按品种项下规定的限值,且供试品溶液与标准品稀释液的注入体积应相等的要求,制备适当浓度的供试品溶液。

7.3 检查法

取健康合格、体重300g以上的成年雄性大鼠,用适宜的麻醉剂(如腹腔注射乌拉坦1g/kg)麻醉后,固定于保温手术台上,分离气管,必要时插入插管,以使呼吸通畅。在一侧颈静脉或股静脉插入静脉插管,供注射药液用,按体重每100g注入肝素溶液50~100单位,然后剥离另一侧颈动脉,插入与测压计相连的动脉插管,在插管与测压计通路中充满含适量肝素钠的氯化钠注射液。全部手术完毕后,将测压计的读数调节到与动物血压相当的高度,开启动脉夹,记录血压。缓缓注入适宜的交感神经阻断药(如甲磺酸酚妥拉明,按大鼠每100g体重注入0.1mg,隔5~10分钟用相同剂量再注射一次),待血压稳定后,即可进行药液注射。各次注射速度应基本相同,并于注射后立即注入氯化钠注射液0.5ml,相邻两次注射的间隔时间应基本相同(一般约为5~10分钟),每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行。

选定高低两剂量的垂体后叶标准品稀释液(ml),高低剂量之比约为1:0.6,低剂量应能使大鼠血压升高1.33~3.33kPa,将高低剂量轮流重复注入2~3次,如高剂量所致反应的平均值大于低剂量所致反应的平均值,可认为该动物的灵敏度符合要求。

在上述高低剂量范围内选定标准品稀释液的剂量(dS),供试品溶液按品种项下规定的剂量(dT),照下列次序注射一组4个剂量:dS、dT、dT、dS,然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较;如dT所致的反应值均不大于dS所致反应值的一半,则判定供试品的升压物质检查符合规定。否则应按上述次序继续注射一组4个剂量,并按相同方法分别比较两组内各对dS、dT所致的反应值;如dT所致的反应值均不大于dS所致的反应值,则判定供试品的升压物质检查符合规定,如dT所致的反应值均大于dS所致的反应值,则判定供试品的升压物质检查不符合规定;否则应另取动物复试。如复试的结果仍有dT所致的反应值大于dS所致的反应值,则判定供试品的升压物质检查不符合规定。

8 附录Ⅺ G 降压物质检查法

本法系比较组胺对照品(S)与供试品(T)引起麻醉猫血压下降的程度,以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。

8.1 对照品溶液的制备

精密称取磷酸组胺对照品适量,按组胺计算,加水溶解使成每1ml中含1.0mg的溶液,分装于适宜的容器内,4~8℃贮存,经验证保持活性符合要求的条件下,可在3个月内使用。

8.2 对照品稀释液的制备

临用前,精密量取组胺对照品溶液适量,用氯化钠注射液制成每1ml中含组胺0.5μg的溶液。供试品溶液的制备  按品种项下规定的限值,且供试品溶液与标准品稀释液的注入体积应相等的要求,制备适当浓度的供试品溶液。

8.3 检查法

取健康合格、体重2kg以上的猫,雌者应无孕,用适宜的麻醉剂(如巴比妥类)麻醉后,固定于保温手术台上,分离气管,必要时插入插管以使呼吸畅通,或可进行人工呼吸。在一侧颈动脉插入连接测压计的动脉插管,管内充满适宜的抗凝剂溶液,以记录血压,也可用其他适当仪器记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管,供注射药液用。试验中应注意保持动物体温。全部手术完毕后,将测压计调节到与动物血压相当的高度(一般为13.3~20.0kPa),开启动脉夹,待血压稳定后,方可进行药液注射。各次注射速度应基本相同,每次注射后立即注入一定量的氯化钠注射液,每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行,且相邻两次注射的间隔时间应尽量保持一致。

自静脉依次注入上述对照品稀释液,剂量按动物体重每1kg注射组胺0.05μg、0.1μg及0.15μg,重复2~3次,如0.1μg剂量所致的血压下降值均不小于2.67kPa,同时相应各剂量所致反应的平均值有差别,可认为该动物的灵敏度符合要求。取对照品稀释液按动物体重每1kg注射组胺0.1μg的剂量(dS),供试品溶液按品种项下规定的剂量(dT),照下列次序注射一组4个剂量:dS、dT、dT、dS。然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较;如dT所致的反应值均不大于dS所致反应值的一半,则判定供试品的降压物质检查符合规定。否则应按上述次序继续注射一组4个剂量,并按相同方法分别比较两组内各对dS、dT剂量所致的反应值;如dT所致的反应值均不大于dS所致的反应值,则判定供试品的降压物质检查符合规定;如dT所致的反应值均大于dS所致的反应值,则判定供试品的降压物质检查不符合规定;否则应另取动物复试。如复试的结果仍有dT所致的反应值大于dS所致的反应值,则判定供试品的降压物质检查不符合规定。

所用动物经灵敏度检查如仍符合要求,可继续用于降压物质检查。

9 附录Ⅺ H 无菌检查法

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识,并经过无菌技术的培训。

9.1 培养基培养基的制备及培养条件

培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃、避光的环境,若保存于非密闭容器中,一般在3周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在1年内使用。

1.硫乙醇酸盐流体培养基

酪胨(胰酶水解)15.0g、氯化钠2.5g、葡萄糖5.0g、新配制的0.1%刃天、

L-胱氨酸0.5g、青溶液1.0ml、硫乙醇酸钠0.5g(或硫乙醇酸)(0.3ml)、琼脂0.75g、水1000ml、酵母浸出粉5.0g

除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青溶液,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则,须经100℃水浴加热至粉红色消失(不超过20分钟),迅速冷却,只限加热一次,并防止被污染。

硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃培养。

2.改良马丁培养基

胨5.0g、磷酸氢二钾1.0g、酵母浸出粉2.0g、硫酸镁0.5g、葡萄糖20.0g、水1000ml    除葡萄糖外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH值约为6.8,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装,灭菌。

改良马丁培养基置23~28℃培养。

3.选择性培养基

按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂灭活剂或表面活性剂,其用量同方法验证试验。

4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查)胨10.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖5.0g、水1000ml、牛肉浸出粉3.0g

除葡萄糖外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

5.营养肉汤培养基

胨10.0g、氯化钠5.0g、牛肉浸出粉3.0g、水1000ml取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

6.营养琼脂培养基

按上述营养肉汤培养基的处方及制法,加入14.0g琼脂,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

7.改良马丁琼脂培养基

按改良马丁培养基的处方及制法,加入14.0g琼脂,调节pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装,灭菌。

9.2 培养基的适用性检查

无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

9.2.1 无菌性检查

每批培养基随机取不少于5支(瓶),培养14天,应无菌生长。

9.2.2 灵敏度检查

9.2.2.1 菌种

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]

铜绿假单胞菌(Pseudmnonas aeruginosa)(CMCC(B) 10 104]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64 941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]

9.2.2.2 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,23~28℃培养24~48小时,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

9.2.2.3 培养基接种

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支,分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天;取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照,培养5天。逐日观察结果。

9.2.2.4 结果判断

空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。

9.3 稀释液、冲洗液及其制备方法

稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1. 0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,调节pH值至7.1±0.2,分装,灭菌。

2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液  取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,分装,灭菌。

根据供试品的特性,可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。

如需要,可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

9.4 方法验证试验

当建立产品的无菌检查法时,应进行方法的验证,以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时,检查方法应重新验证。

验证时,按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。

9.4.1 菌种及菌液制备

除大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]外,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。

9.4.2 薄膜过滤法

取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌,过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中,或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度培养3~5天。各试验菌同法操作。

9.4.3 直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管,分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管,分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量,另1管作为对照,置规定的温度培养3~5天。

9.4.4 结果判断

与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法验证试验。

方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

9.5 供试品的无菌检查

9.5.1 检验数量

检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外,出厂产品按表1规定;上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下,供试品无菌检查若采用薄膜过滤法,应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用;若采用直接接种法,应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。

9.5.2 检验量

是指一次试验所用的供试品总量(g或ml)。除另有规定外,每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两份培养基,则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时,检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量,只要供试品特性允许,应将所有容器内的全部内容物过滤。

9.5.3 阳性对照

应根据供试品特性选择阳性对照菌:无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品,以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验,加菌量小于100cfu,供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48~72小时应生长良好。

9.5.4 阴性对照

供试品无菌检查时,应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。无菌试验过程中,若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂,应证明其有效性,且对微生物无毒性。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品、性状允许,应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。

操作时,用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果容器内有一定的真空度,可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤器的针头),向容器内导入无菌空气,再按无菌操作启开容器取出内容物。

9.6 供试品处理及接种培养基

除另有规定外,按下列方法进行。

9.6.1 1.薄膜过滤法

薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器,也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm,直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml,且总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤

水溶液供试品  取规定量,直接过滤,或混合至含适量稀释液的无菌容器内,混匀,立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂,须用冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数一般不少于3次。所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后,如用封闭式薄膜过滤器,分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器,取出滤膜,将其分成3等份,分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中,其中一份作阳性对照用。

可溶于水的固体制剂供试品  取规定量,加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶,然后照水溶液供试品项下的方法操作。

β-内酰胺类抗生素供试品  取规定量,按水溶液或固体制剂供试品的处理方法处理,立即过滤,用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含适量β-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基,必要时培养基中可加少量的β-内酰胺酶;或将滤膜直接接种至含适量β-内酰胺酶的培养基中。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。

非水溶性制剂供试品  取规定量,直接过滤;或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中,充分混合,立即过滤。用含0.1%~1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。

可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品  取规定量,混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中,剧烈振摇,使供试品充分溶解,如果需要可适当加热,但温度不得超过44℃,趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品,于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯的供试液中加入不少于100ml的稀释液,充分振摇萃取,静置,取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

注①无菌十四烷酸异丙酯的制备  采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜,在140℃干热灭菌2小时。

无菌气(喷)雾剂供试品  取规定量,将各容器置至少-20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔,释放抛射剂后再无菌开启容器,并将供试品转移至无菌容器中,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。装有药物注射器供试品  取规定量,排出注射器中的内容物至无菌容器中,若需要可吸入稀释液或用标签所示的溶剂溶解,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。具有导管的医疗器具(输血输液袋等)供试品  取规定量,每个最小包装用50~100ml冲洗液分别冲洗内壁,收集冲洗液于无菌容器中,然后照水溶液供试品项下的方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。

9.6.2 2.直接接种法

直接接种法即取规定量的供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外,每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,改良马丁培养基每管装量不少于10ml。若供试品具有抑菌作用,可加入适量的无菌中和剂或灭活剂,或加大每个容器的培养基用量。供试品检查时,培养基的用量和高度同方法验证试验。

混悬液等非澄清水溶液供试品  取规定量,接种至各管培养基中。

固体制剂供试品  取规定量,直接接种至各管培养基中,或加入适宜的溶剂溶解,或按标签说明复溶后,取规定量接种至各管培养基中。

非水溶性制剂供试品  取规定量,混合,加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化,接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的各管培养基中。

敷料供试品  取规定数量,以无菌操作拆开每个包装,于不同部位剪取约100mg或1cm×3cm的供试品,接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

肠线、缝合线等供试品  肠线、缝合线及其他一次性使用的医用材料按规定量取最小包装,无菌拆开包装,接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

灭菌医用器具供试品  取规定量,必要时应将其拆散或切成小碎段,接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。放射性药品  取供试品1瓶(支),接种于装量为7.5ml

的硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中。每管接种量为0.2ml。

9.7 培养及观察

上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上判断有无微生物生长,可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中,细菌培养2天、真菌培养3天,观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊;或取培养液涂片,染色,镜检,判断是否有菌。结果判断

阳性对照管应生长良好,阴性对照管不得有菌生长。否则,试验无效。

若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符合规定,除非能充分证明试验结果无效,即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时,方可判试验结果无效:

(1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求;

(2)回顾无菌试验过程,发现有可能引起微生物污染的因素;

(3)供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。

试验若经确认无效,应重试。重试时,重新取同量供试品,依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定;若有菌生长,判供试品不符合规定。

表1 批出厂产品最少检验数量

供试品

批产量N(个)

接种每种培养基所需的最少检验数量

注射剂

大体积注射剂(>100ml)

≤100

100<N≤500

>500

10%或4个(取较多者)

10个

2%或20个(取较少者)

2%或10个(取较少者)

眼用及其他非注射产品

≤200

>200

5%或2个(取较多者)

10个

桶装固体原料

抗生素原料药(≥5g)

≤4

4<N≤50

>50

每个容器

20%或4个容器(取较多者)

2%或10个容器(取较多者)

6个容器

医疗器具

≤100

100<N≤500

>500

10%或4件(取较多者)

10件

2%或20件(取较少者)

注:若供试品每个容器中的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。

表2 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量

供试品装量V(ml)

每支供试品接人每种培养基的最少量

供试品最少检验数量(瓶或支)

≤1

1<V<5

5≤V<20

20≤V<50

50≤V<100

50≤V<100(静脉给药)

100≤V≤500

v>500

全量

半量

2ml

5ml

10ml

半量

半量

500ml

10①

10

10

10

10

10

6

6①

①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。

表3  固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量

供试品装量M

每支供试品接入每种培养基的最少量

供试品最少检验数量(瓶或支)

M<50mg

50mg≤M<300mg

300mg≤M<5g

M≥5g

外科用敷料棉花及纱布

缝合线、一次性医用材料

带导管的一次性医疗器具(如输液袋)

其他医疗器具

全量

半量

150mg

500mg

取100mg或1cm×3cm

整个材料③

整个器具③(切碎或拆散开)

10①

10

10

10②

10

10①

10

①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。

②抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的最少检验数量为6瓶(或支),桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。

③如果医用器械体积过大,培养基用量可在2000ml以上,将其完全浸没。

10 附录Ⅺ J 微生物限度检查法

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告。

10.1 检验量

检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。

除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。

检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。

10.2 供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。

除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。

10.2.1 1.液体供试品

取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1: 10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

10.2.2 2.固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1: 10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

10.2.3 3.需用特殊方法制备供试液的供试品

10.2.3.1 (1)非水溶性供试品

方法1  取供试品5g(或5ml),加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1: 20的供试液。

方法2  取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录Ⅺ H 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5~10分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1: 10的供试液。

10.2.3.2 (2)膜剂供试品

取供试品100cm2,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml(必要时可增加稀释液),浸泡,振摇,作为1: 10的供试液。

10.2.3.3 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml,置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1: 10的供试液。

10.2.3.4 (4)气雾剂喷雾剂供试品

取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80)中,混匀,取相当于10g或10ml的供试品,再稀释成1: 10的供试液。

10.2.3.5 (5)贴剂供试品

取规定量供试品,去掉贴剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀释剂中,用力振荡至少30分钟,制成供试液。贴剂也可采用其他适宜的方法制备成供试液。

10.2.3.6 (6)具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时,采用下列方法进行处理,以消除供试液的抑菌活性,再依法检查。常用的方法如下。

①培养基稀释法  取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少,至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml,每1ml供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。

②离心沉淀法  取一定量的供试液,500转/分钟离心3分钟,取全部上清液混合。用于细菌检查。

③薄膜过滤法  见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。

④中和法  凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

10.3 细菌、霉菌及酵母菌计数

10.3.1 计数培养基的适用性检查

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

菌种  试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitis)[CMCC(B) 63 501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]

菌液制备  接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

适用性检查  取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置30~35℃培养48小时,计数;取白色念珠茵、黑曲霉各50~100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72小时,计数;取白色念珠菌50~100cfu,注入无菌平皿中,立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72小时,计数。同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

结果判定  若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。

10.3.2 计数方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。

验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。菌种及菌液制备  同计数培养基的适用性检查。

10.3.2.1 验证方法

验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

(1)试验组  平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数。

(2)菌液组  测定所加的试验菌数。

(3)供试品对照组  取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

(4)稀释剂对照组  若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

10.3.2.2 结果判断

在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌数回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法(常见干扰物的中和剂或灭活方法见表1)等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。

表1  常见干扰物的中和剂或灭活方法

干扰物

可选用的中和剂或灭活方法

戊二醛

亚硫酸氢钠

酚类、乙醇、吸附物

稀释法

醛类

稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐

季铵类化合物(QACs)、对羟基苯甲酸

卵磷脂、聚山梨酯

汞类制剂

亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐

双胍类化合物

卵磷脂

碘酒、洗必泰

聚山梨酯

卤化

硫代硫酸盐

乙二胺四乙酸(EDTA)

镁或钙离子

磺胺

对氨基苯甲酸

β-内酰胺类抗生素

β-内酰胺酶

若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是,供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用。因此,根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。

验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

10.4 供试品检查

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成1: 10、1:102、1:103等稀释级的供试液。

10.4.1 1.平皿法

根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验  取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。

培养和计数  除另有规定外,细菌培养3天,霉菌、酵母菌培养5天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数;酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。含蜂蜜王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数。菌数报告规则  细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

10.4.2 2.薄膜过滤法

采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

10.4.2.1 阴性对照试验

取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

10.4.2.2 培养和计数

培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。

10.4.2.3 菌数报告规则

以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数;若滤膜上无菌落生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品),或<1乘以稀释倍数的值报告菌数。

10.5 控制菌检查

控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

10.5.1 菌种

对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50 094]

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10 104]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64 941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]

10.5.2 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100 cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。

10.5.3 适用性检查

控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各培养基的检测项目及所用菌株见表2。

表2 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查

控制菌检查

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

大肠菌群

乳糖胆盐发酵培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

乳糖发酵培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

沙门菌

营养肉汤培养基

促生长能力

乙型副伤寒沙门菌

硫磺酸钠亮绿培养基

促生长能力

乙型副伤寒沙门菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺菌属琼脂培养基

促生长能力+指示能力

乙型副伤寒沙门菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力+指示能力

乙型副伤寒沙门菌

三糖铁琼脂培养基

指示能力

乙型副伤寒沙门菌

铜绿假单胞菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

大肠埃希菌

绿脓菌素测定用培养基

促生长能力+指示能力

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

亚碲酸盐肉汤培养基

促生长能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基

促生长能力+指示能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

梭菌

梭菌增菌培养基

促生长能力

生孢梭菌

哥伦比亚琼脂培养基

促生长能力

生孢梭菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖液体培养基

促生长能力

白色念珠菌

沙氏葡萄糖琼脂培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

念珠菌显色培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

抑制能力

大肠埃希菌

1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

10.5.3.1 液体培养基促生长能力检查

分别接种不大于100cfu的试验菌(表2)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。

10.5.3.2 固体培养基促生长能力检查

取试验菌各0.1ml(含菌数50~100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

10.5.3.3 培养基抑制能力检查

接种不少于100cfu的试验菌(表2)于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养,试验菌应不得生长。

10.5.3.4 固体培养基指示能力检查

取试验菌各0.1ml(含菌数不大于100cfu)(表2)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

10.5.3.5 液体培养基指示能力检查

分别接种不大于100cfu的试验菌(表2)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

10.6 控制菌检查方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证。

验证时,依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

10.6.1 菌种及菌液制备

同控制菌检查用培养基的适用性检查。

10.6.2 验证方法

取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

10.6.3 结果判断

若上述试验检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

10.7 供试品检查

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。

10.7.1 阳性对照试验

阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加菌量为10~100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

10.7.2 阴性对照试验

取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查,作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。

(1)大肠埃希菌(Escherichia coli)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,于5小时、24小时在366nm紫外光下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性、靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌;如MUG阳性、靛基质阴性,或MUG阴性、靛基质阳性,则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,确认是否为大肠埃希菌。

表3 大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润

(2)大肠菌群(Coliform)  取含适量(不少于10ml)的乳糖胆盐发酵培养基管3支,分别加入1: 10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)、1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、1:1000的供试液1ml(含供试品0.001g或0.001ml),另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18~24小时。

乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气,判该管未检出大肠菌群;若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

若平板上无菌落生长,或生长的菌落与表4所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似,且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验

表4  大肠菌群菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

紫黑色、紫红色、红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润

麦康凯琼脂

鲜桃红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润

确证试验  从上述分离平板上挑选4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24~48小时。若产酸产气,判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数,按表5报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表5 可能的大肠菌群数

各供试品量的检出结果

可能的大肠菌群数N

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.001g或0.001ml

(个/g或ml)

+

+

+

-

+

+

-

-

+

-

-

-

>103

102<N<103

10<N<102

<10

注:+代表检出大肠菌群;-代表未检出大肠菌群。

(3)沙门菌(Salmonella)  取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量(不少于200ml)的营养肉汤培养基中,用匀浆仪或其他适宜方法混匀,培养18~24小时。

取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18~24小时后,分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18~24小时(必要时延长至40~48小时)。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6所列的特征,判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选2~3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18~24小时,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色、底层无黑色,判供试品未检出沙门菌。否则,应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验,确认是否为沙门菌。

表6 沙门菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

胆盐硫乳琼脂

无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色

沙门、志贺菌属琼脂

无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色

曙红亚甲蓝琼脂

无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落

麦康凯琼脂

无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色

(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时。取上述培养物,划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。

氧化酶试验  取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上,滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素( Pyocyanin)试验  取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上,培养24小时,加三氯甲烷3~5ml至培养管中,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲烷相移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。若盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照,阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性,判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性,应继续进行适宜的鉴定试验,确认是否为铜绿假单胞菌。

(5)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。取上述培养物,划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,培养24~72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表7所列特征,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

表7 金黄色葡萄球菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

甘露醇氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有黄色环,菌落直径0.7~1mm

卵黄氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有卵磷脂分解的乳浊圈,菌落直径1~2mm

若平板上生长的菌落与表7所列的菌落特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色,并接种于营养肉汤培养基中,培养18~24小时,做血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验  取灭菌小试管3支,各加入血浆和无菌水混合液(1:1)0.5ml,再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml,即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养,3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如,阳性对照管血浆应凝固,若试验管血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性,否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时,应另制备血浆,重新试验。若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

(6)梭菌(Clostridium)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)2份,其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml,分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上,置厌氧条件下培养48~72小时。若平板上无菌落生长,判供试品未检出梭菌;若平板上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氢酶试验  取上述平板上的菌落,置洁净玻片上,滴加3%过氧化氢试液,若菌落表面有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢,过氧化氢酶试验阴性,判供试品检出梭菌,否则判供试品未检出梭菌。

(7)白色念珠菌(Candida albicans)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液体培养基中,培养48~72小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色,偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大,颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长,判供试品未检出白色念珠菌。若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色,挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上,培养24~48小时。取培养物进行染色、镜检及芽管试验。

芽管试验  挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种于加有一滴血清的载玻片上,益上盖玻片,置湿

润的平皿内,于35~37℃培养1~3小时,置显微镜下观察孢子上有否长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰阳性菌,显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管,判供试品未检出白色念珠菌。

10.7.3 结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定,应从同一批样品中随机抽样,独立复试两次,以3次结果的平均值报告菌数。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定,判供试品符合规定;若其中任何一项不符合该品种项下的规定,判供试品不符合规定。

10.7.4 稀释液

稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液  照无菌检查法(2010年版药典二部附录Ⅺ H)制备。

2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液按缓冲液(2010年版药典二部附录XV D)配制后,过滤,分装,灭菌。

如需要,可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

3. 0.9%无菌氯化钠溶液  取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装,灭菌。

10.8 培养基及其制备方法

培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基

照无菌检查法(2010年版药典二部附录Ⅺ H)制备。

2.玫瑰红钠琼脂培养基

胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g葡萄糖10.0g、琼脂14.0g磷酸二氢钾1.0g、水1000ml、硫酸镁0.5g

除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,加入葡萄糖、玫瑰红钠,分装,灭菌。

3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD

胨10.0g、琼脂14.0g、酵母浸出粉5.0g、水1000ml、葡萄糖20.0g

除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,加入葡萄糖,分装,灭菌。

4.胆盐乳糖培养基(BL)

胨20.0g、磷酸二氢钾1.3g、乳糖5.0g、牛胆盐2.0g(或去氧胆酸钠)(0.5g)、氯化钠5.0g磷酸氢二钾4.0g、水1000ml

除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠,分装,灭菌。

5.乳糖胆盐发酵培养基

胨20.0g、0.04%溴甲酚紫指示液25ml、乳糖10.0g、水1000ml、牛胆盐5.0g

除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入0.04%溴甲酚紫指示液,根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。

6.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)

营养琼脂培养基100ml、曙红钠指示液2ml、20%乳糖溶液5ml、亚甲蓝指示液1.3~1.6ml、取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液,摇匀,倾注平皿。

7.麦康凯琼脂培养基(MacC)

胨20.0g、1%中性红指示液3ml、乳糖10.0g、琼脂14.0g、牛胆盐5.0g、水1000ml、氯化钠5.0g

除乳糖、1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至约60℃,倾注平皿。

8. 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)培养基

胨10.0g、磷酸二氢钾(无水)0.9g、硫酸锰0.5mg、磷酸氢二钠(无水)6.2g、硫酸锌0.5mg、亚硫酸钠40mg、硫酸镁0.1g、去氧胆酸钠1.0g、氯化钠5.0g、MUG75mg、氯化钙50mg、水1000ml除MUG外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入MUG,溶解,每管分装5ml,灭菌。

9.三糖铁琼脂培养基(TSI)

胨20.0g、硫酸亚铁0.2g、牛肉浸出粉5.0g、硫代硫酸钠0.2g、乳糖10.0g、0.2%酚磺酞指示液12.5ml、蔗糖10.0g、琼脂12.0g、葡萄糖1.0g、水1000ml、氯化钠5.0g

除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,制成高底层(2~3cm)短斜面。

10.四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)

胨5.0g、硫代硫酸钠30.0g、牛胆盐1.0g、水1000ml、碳酸钙10.0g

取上述成分,混合,微温溶解,灭菌。

临用前,取上述培养基,每10ml加入碘试液0.2ml和亮绿试液0.1ml,混匀。

11.沙门、志贺菌属琼脂培养基(ss)

胨5.0g、硫代硫酸钠8.5g、牛肉浸出粉5.0g、中性红指示液2.5ml、乳糖10.0g、亮绿试液0.33ml、牛胆盐8.5g、琼脂16.0g、枸橼酸钠8.5g、水1000ml、枸橼酸铁铵1.0g

除乳糖、中性红指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,滤过,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

12.胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)

胨20.0g、枸橼酸钠1.0g、牛肉浸出粉3.0g、枸橼酸铁铵1.0g、乳糖10.0g、中性红指示液3ml、蔗糖10.0g、琼脂16.0g、去氧胆酸钠1.0g、水1000ml、硫代硫酸钠2.3g

除糖、指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余成分,摇匀,冷至60℃,倾注平皿。

13.溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

胨10.0g、溴化十六烷基三甲铵0.3g、牛肉浸出粉3.0g、琼脂14.0g、氯化钠5.0g、水1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂,加热溶化后,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

14.亚碲酸盐肉汤培养基

临用前,取灭菌的营养肉汤培养基,每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠(钾)试液0.2ml,混匀,即得。

15.卵黄氯化钠琼脂培养基

胨6.0g、10%氯化钠卵黄液100ml、牛肉浸出粉1.8g、琼脂14.0g、氯化钠30.0g、水650ml

除10%氯化钠卵黄液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1,灭菌,待冷至约60℃,以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液,充分振摇,倾注平皿。

10%氯化钠卵黄液的制备  取新鲜鸡蛋1个,以无菌操作取出卵黄,放人10%无菌氯化钠溶液100ml中,充分振摇,即得。

16.甘露醇氯化钠琼脂培养基

胨10.0g、酚磺酞指示液2.5ml、牛肉浸出粉1.0g、琼脂14.0g、甘露醇10.0g、水1000ml、氯化钠75.0g

除甘露醇、酚磺酞指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入琼脂,加热溶化后,滤过,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

17.乳糖发酵培养基

胨20.0g、乳糖10.0g、0.04%溴甲酚紫、水1000ml、指示液25ml

除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入指示液,分装于含倒管的小试管中,每管3ml。灭菌。

18.绿脓菌素(Pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂培养基)

胨20.0g、甘油10ml、氯化镁(无水)1.4g、琼脂14.0g、硫酸钾(无水)10.0g、水1000ml

取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入甘油及琼脂,加热溶化,混匀,分装于试管,灭菌,置成斜面。

19.梭菌增菌培养基

牛肉浸出粉10.0g、盐酸半胱氨酸0.5g、胨10.0g、氯化钠5.0g、酵母浸出粉3.0g、醋酸钠3.0g、可溶性淀粉1.0g、琼脂0.5g、葡萄糖5.0g、水1000ml

取上述成分,混合,加热煮沸使溶解,调节pH值使灭菌后为6.8±0.2,加热溶化,滤过,分装,灭菌。

20.哥伦比亚琼脂培养基

酪蛋白胰酶消化物10.0g、肉胃酶消化物5.0g、心胰酶消化物3.0g、酵母浸出粉5.0g、玉米淀粉1.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、水1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶化,滤过,分装,灭菌,冷至45~50℃,加入相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素,混匀,倾注平皿。

21.沙氏葡萄糖液体培养基

胨10g、葡萄糖40g、水1000ml

除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过。加入葡萄糖,溶解,分装,灭菌。

22.沙氏葡萄糖琼脂培养基

胨10g、水1000ml、葡萄糖40g、琼脂14g

除琼脂和葡萄糖外,混合,微温溶解,滤过。加入琼脂和葡萄糖,溶解,分装,灭菌。

23.(科玛嘉)念珠菌显色培养基①

胨1.2g、琼脂15g、氢罂素0.5g、灭菌水1000ml、色素22.0g

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值至6.3±0.2。滤过,加入琼脂,加热煮沸,不断搅拌至琼脂完全溶解,倾注平皿。

①本检查法中白色念珠菌检查所描述该菌在念珠菌显色培养基上的菌落特征,是指该菌在法国科玛嘉公司提供的科玛嘉念珠菌显色培养基上生长的菌落特征。给出这一信息是为了方便本方法的使用者,并不表示对该公司产品的认可。若其他等效产品具有相同的效果,那么也可使用其他等效的产品。

24. 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

黄色玉米粉40g、琼脂10~15g、聚山梨酯80 10ml、水1000ml

取玉米粉、聚山梨酯80及蒸馏水500ml,混合,65℃加热30分钟,混匀,用纱布滤过,补足原水量。取琼脂,水500ml,混合,加热溶解。将以上两种溶液混合,摇匀,分装,灭菌。

微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验,原料及辅料的检验,新药标准制订,进口药品标准复核,考察药品质量及仲裁等,除另有规定外,其微生物限度均以本标准为依据。

1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂  应符合无菌检查法规定。    2.口服给药制剂

细菌数每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数  每1g或1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。3.局部给药制剂

3.1 用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂  应符合无菌检查法规定。

3.2 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

细菌数每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数  每1g、1ml或10cm2不得过10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌  每1g、1ml或10cm2不得检出。

大肠埃希菌  鼻及呼吸道给药的制剂,每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.3 阴道尿道给药制剂

细菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌数和酵母菌数  每1g、1ml或10cm2应小于10cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌  每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.4 赢肠给药制剂

细菌数  每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。霉菌和酵母菌数  每1g或1ml不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌  每1g或1ml不得检出。

3.5 其他局部给药制剂

细菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌  每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.含动物组织(包括提取物)的口服给药制剂  每10g或10ml还不得检出沙门菌。

5.有兼用途径的制剂  应符合各给药途径的标准。

6.霉变、长螨者  以不合格论。

7.原料及辅料  参照相应制剂的微生物限度标准执行。

11 附录Ⅺ K 过敏反应检查法

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内,间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发,观察动物出现过敏反应的情况,以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。

供试用的豚鼠应健康合格,体重250~350g,雌鼠应无孕。在试验前和试验过程中,均应按正常饲养条件饲养。做过本试验的豚鼠不得重复使用。

11.1 供试品溶液的制备

除另有规定外,按品种项下规定的浓度制备供试品溶液。

11.2 检查法

除另有规定外,取上述豚鼠6只,隔日每只每次腹腔或适宜的途径注射供试品溶液0.5ml,共3次,进行致敏。每日观察每只动物的行为和体征,首次致敏和激发前称量并记录每只动物的体重。然后将其均分为2组,每组3只,分别在首次注射后第14日和第21日,由静脉注射供试品溶液1ml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应症状

11.3 结果判断

静脉注射供试品溶液30分钟内,不得出现过敏反应。如在同一只动物上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫癜呼吸困难等现象中的2种或2种以上,或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐休克、死亡现象之一者,判定供试品不符合规定。

12 附录Ⅺ L 溶血与凝聚检查法

本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合,温育一定时间后,观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。

12.1 2%红细胞混悬液的制备

取健康家兔血液,放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟,或用玻璃棒搅动血液,以除去纤维蛋白原,使成脱纤血液。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量,摇匀,每分钟1000~1500转离心15分钟,除去上清液,沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2~3次,至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液制成2%的混悬液,供试验用。

12.2 供试品溶液的制备

除另有规定外,按品种项下规定的浓度制成供试品溶液。

12.3 检查法

取洁净玻璃试管5只,编号,1、2号管为供试品管,3号管为阴性对照管,4号管为阳性对照管,5号管为供试品对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液、蒸馏水,混匀后,立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育。3小时后观察溶血和凝聚反应。

试管编号

1、2

3

4

5

2%红细胞悬液/ml

2.5

2.5

2.5

0.9%氯化钠溶液/ml

2.2

2.5

4.7

蒸馏水/ml

2.5

供试品溶液/ml

0.3

0.3

如试管中的溶液呈澄明红色,管底无细胞残留或有少量红细胞残留,表明有溶血发生;如红细胞全部下沉,上清液无色澄明,或上清液虽有色澄明,但1、2号管和5号管肉眼观察无明显差异,则表明无溶血发生。

若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀,轻轻倒转3次仍不分散,表明可能有红细胞凝聚发生,应进一步置显微镜下观察,如可见红细胞聚集为凝聚。

12.4 结果判断

当阴性对照管无溶血和凝聚发生,阳性对照管有溶血发生,若供试品管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚,判定供试品符合规定;若供试品管的溶液在3小时内发生溶血和(或)凝聚,判定供试品不符合规定。

13 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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