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RIA

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1 概述

RIA(radioimmunoassay,放射免疫分析)是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法,用于定量测定受检标本中的抗原。最初建立的方法模式是以核素标记的抗原与受检标本中抗原竞争的测定模式,为区别于前者,称为免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)。两种方法均在医学检验中得到了广泛应用。

RIA是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性,本法的灵敏度高达ng甚至pg水平。测定的准确性良好,ng量的回收率接近100%。本法特别适用于微量蛋白质激素多肽的定量测定。

2 RIA的基本原理

RIA的基本原理是标记抗原(Ag*)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)的竞争结合反应。它的反应式为:

在这一反应系统中,作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的。抗体的量一般取用能结合40%~50%的标记抗原,而受检标本中的非标记抗原是变化的。根据标本中抗原量的不同,得到不同的反应结果。

假设受检标本中不含抗原时的反应条件为:

4(Ag*)+2(Ab)→2(Ag*Ab)+2(Ag*)(2)

在标本中存在抗原时,举例如下:

4(Ag*)+4(Ag)+(2Ab)→

1(Ag*Ab)+3(Ag*)+1(AgAb)+3(Ag)(3)

当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统时,由于标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力,因此两者相互竞争结合特异性抗体。由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的,故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加,相应地结合较多的抗体,从而抑制标记抗原对抗体的结合,使标记抗原抗体复合物相应减少,游离的标记抗原相应增加,亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比(图16-1)。若将抗原抗体复合物与游离标记抗原分开,分别测定其放射性强度,就可算性结合态的标记抗原(B)与游离态的标记抗原(F)的比值(B/F),或算出其结合率[B/(B+F)],这与标本中的抗量呈函数关系。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应,计算相应的B/F,可以绘制出一条剂量反应曲线(图16-2)。受检标本在同样条件下进行测定,计算B/F值,即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。

图16-1 RIA原理示意图

图16-2 剂量反应曲线

2.1 (一)标记物

标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。前者主要为131I、125I、57Cr60Co;后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。例如125I比活性的理论值是64.38×104GBq/g(1.74×104Ci/g),有较长半衰期14C最大比活性是166.5GBq/g(4.5Ci/g)。两者相比,1mol125I或14C结合到抗原上,125I的敏感度约比14C大3900倍。又因为125I有合适的半衰期,低能量的γ射线易于标记,因而125I是目前常用的放射免疫分析标记物。

2.2 (二)标记方法

标记125I的方法可分两大类,即直接标记法和间接标记法。

直接标记法是将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上。此法优点是操作简便,为125I和蛋白质的单一步骤的结合反应,它能使较多的125I结合在蛋白质上,故标记物具有高度比放射性。但此法只能用于标记含酪氨酸的化合物。此外,含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性,则该活性易因标记而受损伤

间接标记法(又称连接法)是以125I标记在载体上,纯化后再与蛋白质结合。由于操作较复杂,标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。但此法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质。如直接法标记引起蛋白质酪氨酸结构改变而损伤其免疫及生物活性时,也可采用间接法。它的标记反应较为温和,可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失。下面介绍最常用的氯胺T直接标记法。

氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐,在水溶液中逐渐分解形成次氯酸,是一种氧化剂。在偏碱溶液中(pH7.5),氯胺T将125I的I氧化为I+,I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢,形成二碘酪氨酸。反应式如下:

放射性碘标记率的高低与抗原(蛋白质或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有关,当分子中含有较多的酪氨酸,又暴露在外时,则标记率就高。

标记方法:将纯化抗原和125I加入小试管底部,然后将新鲜配制的氯胺T快速冲入,混匀振荡数十秒~2min后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加入KI溶液稀释。然后在葡聚糖G柱上分离,逐管收集。分别用井型闪烁计数器测定放射性强度(脉冲数/min,cpm),前部为标记抗原峰,后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管内加等量1%白蛋白稳定剂,此即为标记抗原液。

2.3 (三)标记物的鉴定

1.放射性游离碘的含量用三氯醋酸(预先在受鉴定样品中加入牛血清白蛋白)将所有蛋白质沉淀,分别测定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游离碘在总放射性碘的5%以下。标记抗原在贮存过久后,会出现标记物的脱碘,如游离碘超过5%则应重新纯化去除这部分游离碘。

2.免疫活性标记时总有部分抗原活性损失,但应尽量避免。检查方法是用小量的标记抗原加过量的抗体,反应后分离B和F,分别测定放射性,算出BT%。此值应在80%以上,该值越大,表示抗原损伤越少。

3.放射性比度标记抗原必须有足够的放射性比度。比度或比放射性是指单位重量抗原的放射强度。标记抗原的比放射性用mCi/mg(或mCi/mmol)表示。比度越高,测定越敏感。标记抗原的比度计算是根据放射性碘的利用率(或标记率):

如:5μghGH用2mCiNa125I进行标记,标记率为40%,则

2.4 (四)抗血清的检定

含有特异性抗体的抗血清是RIA的主要试剂,常以抗原免疫小动物诱发产生多克隆抗体而得。抗血清的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。抗血清质量的指标主要有亲和常数、交叉反应率和滴度。

1.亲和常数亲和常数(affinityconstant)常用K值表示。它反映抗体与相应抗原的结合能力。K值的单位为mol/L,即表示1mol抗体稀释至若干L溶液中时,与相应的抗原结合率达到50%。抗血清K值越大,RIA的灵敏度、精密和准确度越佳。抗血清的K值达到109~1012mol/L才适合用于RIA。

2.交叉反应率RIA测定的物质有些具有极为类似的结构,例如甲状腺素T3T4雌激素中的雌二醇雌三醇等。针对一种抗原的抗血清往往对于其类似物发生交叉反应。因此交叉反应率反映抗血清的特异性,交叉反应率过大将影响分析方法的准确性。交叉反应率的测定方法为用与抗血清相应抗原及其类似物用同法进行测定,观察置换零标准管50%时的量。以T3抗血清为例,置换零标准50%T3为1ng,其类似物T4则需200ng,则其交叉反应率为:1/200=0.5%。

3.滴度滴度系指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗体的浓度。在RIA中滴度为在无受检抗原存在时,结合50%标记抗原时抗血清的稀释度。

3 RIA的测定方法

用RIA进行测定时分三个步骤,即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量

3.1 (一)抗原抗体反应

将抗原(标准品和受检标本)、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中,在一定的温度下进行反应一定时间,使竞争抑制反应达到平衡。不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。如受检标本抗原含量较高,抗血清的亲和常数较大,可选择较高的温度(15~37℃)进行较短时间的温育,反之应在低温(4℃)作较长时间的温育,形成的抗原抗体复合物较为牢固。

3.2 (二)B、F分离技术

在放射免疫分析反应中,标记抗原和特异性抗体的含量极微,形成的标记抗原抗体复合物(B)不能自行沉淀,因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀,以完成与游离标记抗原(F)的分离。另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。

1.第二抗体沉淀法这是放射免疫分析中最常用的一种沉淀方法。将产生特异性抗体(第一抗体)的动物(例如兔)的IgG免疫另一种动物(例如羊),制得羊抗兔IgG血清(第二抗体)。由于在本反应系统中采用第一、第二两种抗体,故称为双抗体法。在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体,形成由抗原-第一抗体-第二抗体组成的双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低,其复合物亦极少,无法进行离心分离,为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG,使之与第二抗体形成可见的沉淀物,与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原(B)的沉淀物沉淀,与上清液中的游离标记抗原(F)分离。

将第二抗体结合在颗粒状的固相载体之上即成为固相第二抗体。利用固相第二抗体分离B、F,操作简便、快速。

2.聚乙二醇PEG)沉淀法最近各种放射免疫分析反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。PEG沉淀剂的主要优点是制备方便,沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高,且温度高于30℃时沉淀物容易复溶。

3.PR试剂法是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法。此法保持了两者的优点,节省了两者的用量,而且分离快速、简便。

4.活性炭吸附法小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附,大分子复合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖,使它表面具有一定孔径的网眼,效果更好。在抗原与特异性抗体反应后,加入葡聚糖-活性炭。放置5~10min,使游离抗原吸附在活性炭颗粒上,离心使颗粒沉淀,上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素,强心糖苷和各种药物,因为它们是相对非极性的,又比抗原抗体复合物小,易被活性炭吸附。

3.3 (三)放射性强度的测定

B、F分离后,即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类,液体闪烁计数仪(β射线,如3H、32P、14C等)和晶体闪烁计数仪(β射线,如125131I、57Cr等)。

计数单位是探测器输出的电脉冲数,单位为cpm(计数/分),也可用cps(计数/秒)表示。如果知道这个测量系统的效率,还可算出放射源的强度,即dpm(衰变/分)或dps(衰变/秒)。

每次测定均需作标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图(图16-3)。放射性强度可任选B或F,亦可用计算值B/(B+F)、B/F和B/B0。标本应作双份测定,取其平均值,在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。

图16-3 RIA标准曲线示例

4 RIA在医学检验中的应用

RIA由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质,所以在医学检验中应用极为广泛,常用于测定各种激素(如甲状腺激素性激素胰岛素等)、微量蛋白质、肿瘤标志物(如AFP、CEA、CA-125、CA-199等)和药物(如苯巴比妥、氯丙嗪庆大霉素等)等。各种检测项目均有试剂盒供应,而且仪器设备并不昂贵,所以在国内被广泛采用。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性,必须加以防护,核素实验室的建设须经防疫部门的监督,操作人员须经过特殊训练。另外由于核素有半衰期,试剂盒的货存期较短,因而RIA在应用中有诸多不便之处。特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展,高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美,因此从长远前景看,RIA有被取代的趋势。但在目前,从所需的设备和检测的费用上,RIA还有一定的优越性,还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。

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