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补体结合试验

1 拼音

bǔ tǐ jié hé shì yàn

2 英文参考

complement fixation test

CFT

3 概述

补体结合试验(complementfixationtest,CFT)是用免疫溶血机制做指示系统,来检测另一反应系统抗原抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断,即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进,除了用于传染病诊断和流行病学调查以外,在一些自身抗体肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。

补体结合试验利用抗原抗体复合物同补体结合,把含有已知浓度的补体反应液中的补体消耗掉使浓度减低的现象,以检出抗原或抗体,是高敏度检出方法之一,特别是根据抗原物质的特性,抗原抗体反应不能用沉淀反应凝集反应观察时也可以利用此法。试验由两个阶段组成:首先将经过56℃处理30分钟使补体灭活抗血清,与抗原及补体(通常将豚鼠血清作适当稀释后使用)混合使起反应。第二是加入已同抗绵羊红细胞抗体相结合的绵羊红细胞(致敏红细胞)。在最初阶段对消耗补体建立起足够的抗原抗体反应时,没有发生致敏红细胞的溶血,但补体剩余下来则引起溶血反应。用于检查梅毒的梅毒补体结合反应(瓦氏反应,Wassermann reaction)是最常进行的补体结合试验。

补体的测定包括测定补体总量、溶血活性、单个补体成份和补体片段量以及补体参与试验等。

4 检查名称

补体结合试验

5 分类

血清学检查 > 凝集试验

6 化验取材

血液

7 补体结合试验的原理

抗原抗体复合物可以结合补体,这是补体结合试验的依据。绵羊红细胞和其相应抗体(溶血素)的复合物结合补体后出现溶血现象。因此,绵羊红细胞和溶血素被作为补体结合试验中判断待测系统中有无抗原抗体反应的复合物系统。如待测系统产生抗原抗体复合物,则可结合一定量补体,此时加入溶血系统则不出现溶血。如待测系统中只有抗原或抗体,不能结合补体,加入溶血系统则与游离补体结合而发生溶血,这就是补体结合试验的基本原理。

补体结合试验中有5种成分参与反应,分属于3个系统:①反应系统,即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原);②补体系统;③指示系统,即SRBC与相应溶血素,试验时常将其预先结合在一起,形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统,先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。

如果反应系统中存在待测的抗体(或抗原),则抗原抗体发生反应后可结合补体;再加入指示系统时,由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血,是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体(或抗原),则在液体中仍有游离的补体存在,当加入指示系统时会出现溶血,是为补体结合试验阴性(图14-2)。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体,或用已知抗体来检测相应抗原。

图14-2补体结合试验示意图

8 验方

补体结合试验的改良方法较多,较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。目前以后两种方法应用较为广泛,因为可以节省抗原,血清标本用量较少,特异性也较好。以下叙述以小量法为例,即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml,总量为0.6ml。

9 试剂

(l)巴比妥缓冲液(BBS):称取氯化钠85.0g,氯化镁六水合物1.68g,氯化钙0.28g,巴比妥5.75g,巴比妥钠2.0g,先将巴比妥加入500ml水中加热溶解后,再加其他成分,补加水至2000ml,此为保留液,用时稀释5倍。

(2)抗体(溶血素):应无抗补体现象,国内有商品供应。

(3)2%羊红细胞:用生理盐水离心洗涤后,用BBS配成2%悬液。

(4)补体:豚鼠血清。

1.抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强。如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对照,以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。

2.抗原和抗本的滴定补体结合试验中,抗原与抗体按一定比例结合,因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定,选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100%不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单价)。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原,配加不同稀释度的抗血清,另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统,温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中,抗原一般采用2~4个单位(1:64~1:32),抗体采用4个单位(1:8)。

表14-4抗原和抗体的方阵滴定

抗原 抗血清稀释倍数 抗原对照
1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512  
1:4 4 4 4 4 4 4 3 2 0
1:8 4 4 4 4 4 3 2 1 0
1:16 4 4 4 4 3 2 2 ± 0
1:32 4 4 4 4 3 1 ± 0 0
1:64 4 4 4 2 ± 0 0 0
1:128 4 2 1 0 0 0 0 0 0
1:256 3 1 0 0 0 0 0 0 0
1:512 0 0 0 0 0 0 0 0 0
抗体对照 0 0 0 0 0 0 0 0  

注:1、2、3、4分别表示溶血反应强度+、++、+++、++++;0为不溶血。

3.补体滴定按表14-5逐步加入各试剂,温育后观察最少量补体能产生完全溶血者,确定为1个实用单位,正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血,按比例公式0.12×2:60=0.2:X计算,X=50;即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。

表14-5补体的滴定

管号 1:60补体(ml) 缓冲液(ml) 稀释抗原(ml)   致敏SRBC

(ml)

  结果
1 0.04 0.26 0.1

37℃水

浴30min

0.2

37℃水

浴30min

不溶血
2 0.06 0.24 0.1 0.2 不溶血
3 0.08 0.22 0.1 0.2 微溶血
4 0.10 0.20 0.1 0.2 微溶血
5 0.12 0.18 0.1 0.2 全溶血
6 0.14 0.16 0.1 0.2 全溶血

10 血清标本

采集血液标本后及时分离血清,及时检验或将血清保存于-20℃。血清在试验前应先加热56℃30min(或60℃3min)以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一:①加热提高12;②-20℃冻融后离心去沉淀;③以3mmol/L盐酸处理;④加入少量补体后再加热灭活;⑤以白陶土处理;⑥通入CO2;⑦以小白鼠肝粉处理;⑧用含10%新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。

11 操作方法

血素的滴定:

①取补体1ml,加BBS 9ml,依次稀释成1∶20,1∶30,1∶40,1∶50,1∶60,1∶80,1∶100,1∶200,1∶400,同时取50%的溶血素0.2ml,加BBS 9.8ml,即为1∶100的溶血素,然后继续稀释成1∶800,1∶1600,1∶3200,1∶6400。

②采取方阵排列试管,纵行各管加不同浓度的补体0.1ml,横排各管加溶血素0.1ml(皆应从最高稀释度加起)混匀后,各管加BBS 0.2ml,补体和溶血素对照管各加BBS 0.3ml,最后在各管中加2%羊红细胞0.1ml。各管总量为0.5ml,摇匀,放37℃水箱中30min,观察结果。兹举一例说明(表1):

以完全溶血的补体和溶血素最高稀释度为各自的单位。在实际应用时,溶血素用2U(3200÷2=1600),补体用2.5U(80÷2.5=32)。

(2)正式试验:

①用V型微量反应板操作,每份标本作一个试验孔。一个血清对照孔。各孔内先加BBS 0.025ml。②用稀释棒蘸取血清(0.025ml)加入第一孔,旋转后移入第二孔,共八孔,如此可得1∶2~1∶256稀释。③按表2加入各试剂:

以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂,温育后先观察各类对照管,应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血;抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2U为全溶,1U为全溶略带有少许红细胞,0.5U应不溶。如0.5U补体对照出现全溶表明补体用量过多;如2U对照管不出现溶血,说明补体用量不够,对结果都有影响,应重复进行试验。补体结合试验结果,受检血清不溶血为阳性,溶血为阴性。

表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序

反应物(ml) 待检血清管 阳性对照管 阴性对照管 抗原对照管 补体对照管 红细胞对照管
测定 对照 测定 对照 测定 对照 2U 1U 0.5U  
稀释血清 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
抗原 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.4
2U补体 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
1U补体 0.2
0.5U补体 0.2
混匀,置37℃1h或4℃16~18h                      
致敏红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
混匀,置37℃30min后观察结果                      

12 应用和评价

补体结合试验是一种传统的免疫学技术,能够沿用至今说明它本身有一定的优点:①灵敏度高。补体活化过程有放大作用,比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多,能测定0.05μg/ml的抗体,可与间接凝集法的灵敏度相当。②特异性强。各种反应成分事先都经过滴定,选择了最佳比例,出现交叉反应的机率较小,尤其用小量法或微量法时。③应用面广,可用于检测多种类型的抗原或抗体。④易于普及,试验结果显而易见;试验条件要求低,不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。

补体结合试验可应用在以下几方面:①传染病诊断。病原性抗原及相应抗体的检测。②其他抗原的检测。例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等。③自身抗体检测。

但是补体结合试验参与反应的成分多,影响因素复杂,操作步骤繁锁并且要求十分严格,稍有疏忽便会得出不正确的结果,所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。

13 正常值

阴性:0~1∶10

14 化验结果意义

>1∶10为阳性,诊断布氏杆菌病符合率为97.96%。单份血清效价≥1:16或双份血清效价≥4倍时即可诊断为立克次体感染

15 附注

操作应仔细准确;玻璃器材必须非常清洁;参与试验的各项已知成分必须预先滴定其效价,配制成规定的浓度使用,才能保证结果可靠。

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